林其誰(1937—) 研究員，中國科學(xué)院院士。原中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所所長(1984—1995)，歷任國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃第一、二、三、五屆專家顧問組成員。從事生物膜結(jié)構(gòu)與功能研究，包括線粒體呼吸鏈氧化磷酸化、解偶聯(lián)蛋白、膜脂與多肽相互作用、膜上信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體等。
李伯良(1950—) 研究員。原中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所所長(1995—2000)。從事膽固醇代謝平衡的基因表達調(diào)控研究，包括人ACAT 基因的組織結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控及其與膽固醇代謝平衡過程的生理病理關(guān)系等。
林其誰，李伯良
1965年9月17日是科技界值得懷念的日子，中國科學(xué)研究人員在實驗中觀察到人工全合成牛胰島素的結(jié)晶，確證了人工全合成結(jié)晶牛胰島素工作終于成功。這是世界上第一次用人工方法合成了與天然分子相同化學(xué)結(jié)構(gòu)并具有生物活性的蛋白質(zhì)，標志著人類在認識生命、探索生命奧秘的征途中邁出了里程碑式的飛躍和開拓了人工全合成蛋白質(zhì)的新時代，在生命科學(xué)研究發(fā)展史上有永恒的意義與影響。實際上，人工全合成結(jié)晶牛胰島素的成功完全依賴于一系列的科學(xué)精神。
1 研究項目提出與準備
1958年夏，中科院上海生化所的高級研究人員座談會上提出了三方面研究，其中之一是人工合成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)理論項目。在所長王應(yīng)睞主持所內(nèi)外學(xué)術(shù)交流基礎(chǔ)上，依據(jù)國際上已有氨基酸一級序列結(jié)構(gòu)報道的唯一蛋白質(zhì)是胰島素，生化所于1958年12月18日正式確定了人工合成胰島素項目，并于1959年列入國家科研計劃。這是中國科學(xué)家們，在當時中國環(huán)境下顯示的創(chuàng)新膽略和科學(xué)雄心。
1955年英國桑格闡明胰島素一級結(jié)構(gòu)，由21個氨基酸的A鏈、30個氨基酸的B鏈，通過兩對二硫鍵連接而成，還有A鏈內(nèi)一對二硫鍵，全蛋白有17種氨基酸及分子量為5733等特征。此時，Nature 期刊也曾預(yù)言“合成胰島素將是遙遠的事情”。而中國科學(xué)家們跨越“遙遠”進入人工合成胰島素的前沿項目探索之時，除了掌握國際文獻報道、了解學(xué)術(shù)前沿動態(tài)外，著手進行了一系列艱難的準備工作，包括人工合成胰島素中所必需的原料試劑，如氨基酸來源的解決、各種技術(shù)方法的建立和研究策略、技術(shù)路線的確定等等，以確保項目的實驗探索。這些在當時的生化所都進入較系統(tǒng)性的全面安排和一步一個足印地推進。
2 多路摸索與研究策略
人工合成胰島素一經(jīng)推出，就有針對性地討論了一系列科學(xué)問題。例如：胰島素由兩對二硫鍵連接A、B二條肽鏈組成，是否二條肽鏈可分開合成的問題(涉及完全不同的研究策略和技術(shù)路線)；即使分開合成了A、B二條肽鏈，有關(guān)二硫鍵連接有順接、反接、多接等眾多的可能性，是否能正確連接的問題(當時國外文獻討論對正確連接率很悲觀) ；如能提高合成A、B二條肽鏈的正確連接率，是否獲得的合成胰島素會形成具有生物學(xué)活性構(gòu)型的問題(當時有關(guān)蛋白質(zhì)構(gòu)型研究的方法極其有限) ；假如要合成A、B二條肽鏈，是有機合成、還是酶促或轉(zhuǎn)肽合成相結(jié)合的問題(有關(guān)肽鏈全有機合成，當時國際上最長僅有合成由13個氨基酸殘基組成的多肽鏈的文獻報道) ；如是全有機合成，則涉及合成肽段的適宜長短、肽段之間縮合的方式與方向、合成前后的氨基酸基團保護與去保護的問題(當時國際上還無大于13個氨基酸肽鏈合成的文獻報道)，等等。
在中國當時的極端困難環(huán)境下，生化所以科學(xué)家們的專長領(lǐng)銜，進行合成胰島素前期的兵分五路摸索，包括有機合成、天然胰島素拆合、肽庫及分離分析、酶激活和轉(zhuǎn)肽。經(jīng)過反復(fù)的實驗摸索，不斷的交流討論，及時的分析總結(jié)，在天然胰島素A、B肽鏈拆開再將它們重組合的實驗探索中成功使拆-合重組合胰島素的活性提高到50%時，就果斷地將重心集中到有機合成、胰島素拆合與復(fù)性、分離分析這三方面工作上。因為，前期階段工作摸索的結(jié)果，不但顯示天然胰島素A、B肽鏈的可成功拆開和重組合，還表明只要合成具有正確氨基酸排列順序的A、B肽鏈，在適宜條件下就可使合成A、B肽鏈的正確二硫鍵形成和肽折疊趨向于與天然胰島素相同的特殊構(gòu)型。進而，明確了人工合成胰島素的研究策略，即分別有機合成A 和B兩條肽鏈，再進行組合復(fù)性，最后鑒定生物學(xué)活性和各種理化性質(zhì)。
特別值得一提的是，生化所正式確定人工合成胰島素項目的同時，就摸索并建成了專門制備氨基酸等試劑的工廠——東風生化試劑廠，不但為人工合成胰島素項目，也為我國的相關(guān)研究提供了大量的生化試劑，不愧為轉(zhuǎn)化應(yīng)用的早期典范。
3 實驗設(shè)計與技術(shù)路線
在人工合成胰島素的多路摸索中，不管是天然胰島素拆合實驗以確定研究策略，還是肽鏈有機合成實驗以成熟技術(shù)路線，成功均源自于始終不斷設(shè)計和系統(tǒng)優(yōu)化實驗、始終不斷重復(fù)和交流總結(jié)實驗、始終不斷調(diào)整和大膽探索實驗等。而且，在非常多的各種小試實驗中，確確實實印證了“失敗是成功之母”，科學(xué)前沿探索不但要有膽略，還必須要有毅力和敢于自信、善于堅持。
在天然胰島素拆合早期實驗中，涉及到大量的實驗設(shè)計，有書面總結(jié)的98次實驗(包括胰島素還原和A、B肽鏈的分離純化、定量分析、重氧化等)結(jié)果表明，胰島素活性的出現(xiàn)正是由于拆開的A、B二條肽鏈的正確重組，而非由于少量殘留的天然胰島素。而后的2個月，又進行100多次的胰島素拆合條件及酸性仲丁醇抽提復(fù)性的優(yōu)化實驗，才可重復(fù)地獲得了拆合后的高活性重組合胰島素結(jié)晶，并且進行一系列的生化鑒定包括兔血糖降低和小鼠驚厥活性定量測定、電泳及層析行為分析、酶解圖譜分析及含硫肽段定位等。這些為研究策略和技術(shù)
路線的確定等奠定了厚實的基礎(chǔ)。
在有機合成胰島素肽鏈的實驗中，從制備保護基和縮合劑及其性能分析，建立氨基酸和肽段的縮合方法，到不同氨基酸的特異性保護、不同肽段的縮合方式和縮合方向，同樣涉及非常大量的實驗設(shè)計。而且，在進行了多年的難以計數(shù)的實驗后，才獲得共識性的有機合成技術(shù)路線，提出對胰島素的A、B肽鏈的有機合成既有共性，也有各自特異性。尤其是，有關(guān)縮合肽段的保護與大小，在實驗中不斷調(diào)整，直至達到不同層次的保護基最后均穩(wěn)定且又可全部去除、C端到N端的定向縮合、避免消旋的縮合等，組成了成套的技術(shù)方法。這些大量的每一個難點，都通過了無數(shù)次的實驗設(shè)計解決，也都是胰島素A、B肽鏈有機合成技術(shù)路線的成熟和應(yīng)用的積累。
4 研究創(chuàng)新與協(xié)作突破
人工全合成結(jié)晶牛胰島素，是在國際上無蛋白質(zhì)合成先例報道的背景下起步探索。一經(jīng)啟動實施，就面臨許多關(guān)鍵性步驟，都必須要有創(chuàng)新性的思路和膽略，以期能構(gòu)建適宜的新技術(shù)方法和新研究體系。在我國人工全合成結(jié)晶牛胰島素中關(guān)鍵性的研究創(chuàng)新包括：天然胰島素的拆合、獲得50%以上活性的重組合胰島素結(jié)晶、肽段的定向和無消旋縮合、人工合成肽鏈低損傷的完全去保護基等。
實際上，人工全合成結(jié)晶牛胰島素過程，是不斷的研究創(chuàng)新過程，而且是在協(xié)作中的不斷研究創(chuàng)新，才獲得前沿性突破。特別是在當時的環(huán)境條件下，進行了特定專家負責的幾次協(xié)作，也是獲得人工全合成結(jié)晶牛胰島素突破的重要基礎(chǔ)。人工全合成結(jié)晶牛胰島素項目，最終由中科院上海生化所、有機所和北大化學(xué)系共同完成中，也有兩個階段的協(xié)作。一是在1960年10月中科院上海生化所與有機所之間的協(xié)作組協(xié)調(diào)；二是1964年2月中科院生化所、有機所與北大化學(xué)系的協(xié)作組協(xié)調(diào)。在生化所負責有機合成B肽鏈進展較快的基礎(chǔ)上，協(xié)作組協(xié)調(diào)有機所與北大化學(xué)系有機合成了A肽鏈，確保了生化所利用天然胰島素拆合與重組合復(fù)性的技術(shù)方法及經(jīng)驗進行有機合成A、B兩條肽鏈的成功組合。
5 學(xué)術(shù)思路與科學(xué)實驗
生化所在確定人工合成胰島素項目時，提出許多針對性的學(xué)術(shù)思路，如摸索拆合天然胰島素，摸索有機合成胰島素A、B肽鏈等。人工全合成結(jié)晶牛胰島素中，通過大量的科學(xué)實驗獲得結(jié)果，不斷驗證了這些重要的學(xué)術(shù)思路。
人工全合成結(jié)晶牛胰島素的關(guān)鍵性科學(xué)問題之一，是三對二硫鍵是否能正確連接、正確連接后又能否形成有活性的蛋白質(zhì)構(gòu)型？盡管當時國際上天然胰島素拆合中幾乎觀察不到重組合胰島素的活性，致使國外文獻討論對二硫鍵的正確連接率很悲觀，以及那時研究蛋白質(zhì)構(gòu)型的方法也極其有限，但需要對天然胰島素拆合進行深入科學(xué)實驗，尤其重視的是有活性重組合胰島素的科學(xué)實驗。人工全合成結(jié)晶牛胰島素的成功，是第一次證實了二硫鍵形成具有高選擇性而肽鏈可趨向于折疊成與天然胰島素相同的特殊構(gòu)型，亦是第一次以實驗結(jié)果證明
了蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)取決于一級結(jié)構(gòu)。
人工全合成結(jié)晶牛胰島素的另一關(guān)鍵性科學(xué)問題，有機合成能否達到胰島素A、B兩條肽鏈分別為21、30個氨基酸的長度。這在當時國際上最長僅有合成由13個氨基酸殘基組成的多肽鏈的文獻報道條件下，對此關(guān)鍵性科學(xué)問題也需要進一步的詳細科學(xué)實驗，特別關(guān)注的是不同層次保護基的最終穩(wěn)定性與可去除性、適宜大小肽段的定向縮合等技術(shù)方法。人工全合成結(jié)晶牛胰島素的成功，則是第一次證實了可化學(xué)合成生物大分子，并且意味著蛋白質(zhì)能化學(xué)合成、核酸也能化學(xué)合成，實際上后者確實很快成功。
綜上所述，人工全合成結(jié)晶牛胰島素的成功完全依賴于一系列的科學(xué)精神，實現(xiàn)了繼1828 年德國化學(xué)合成第一個有機分子尿素之后的又一次飛躍，1965年中國化學(xué)合成了第一個生物大分子胰島素，同時使前沿更有信心追求高一級飛躍，如重組合成生命細胞等。當然，還有極重要因素是人，特別是那個年代的專家們與年輕人們的熱情奮進和幾次協(xié)作組組長王應(yīng)睞的核心作用，使闖過了許多異乎尋常的難關(guān)，做了前人所沒有做的事情。另外，值得一提的是，當時的中科院管理，有敢于體現(xiàn)領(lǐng)導(dǎo)責任的各級行政，如當時的上海分院各研究所專家們就沒有一位是“右派分子”，表明行政可確保發(fā)揮專家們帶領(lǐng)年輕人的熱情奮進。
（本文原發(fā)表于《生命科學(xué)》2015年第27卷第6期）