馮佑民(1936—)，河北省灤縣人，1964年畢業(yè)于北京大學(xué)生物系生物化學(xué)專業(yè)，同年分配到中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。主要從事“結(jié)晶胰島素全合成”的后繼研究：胰島素及相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能、胰島素受體、胰島素及其類似物的基因表達、蛋白質(zhì)工程以及單、雙鏈胰島素和相關(guān)蛋白質(zhì)的體外折疊機制等。期間曾先后在美國Miami醫(yī)學(xué)院、紐約MemorialSloan-Ketterring Cancer Center、美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院和法國巴黎十一大學(xué)居里研究所進修或合作研究。
馮佑民
在胰島素合成中，在A鏈內(nèi)和A、B鏈間的3對二硫鍵正確配對是合成成功的關(guān)鍵。結(jié)晶牛胰島素合成成功之后，張友尚先生、朱尚權(quán)先生等人長期進行胰島素結(jié)構(gòu)功能研究，鄒承魯先生團隊進行了蛋白質(zhì)折疊研究，我們在酵母中成功表達了豬胰島素前體(porcine insulin precursor, PIP) 的基因，并建立了胰島素蛋白質(zhì)工程技術(shù)。在這些研究基礎(chǔ)上，我們于21世紀初，開展了單、雙鏈胰島素的體外折疊機制的研究。
鑒于胰島素在體內(nèi)以單一肽鏈被合成為胰島素原(proinsulin) 并完成折疊，連接A、B鏈的肽段(C肽) 被切除，成為成熟的雙鏈胰島素，釋放到血液中。故稱前者為單鏈胰島素，后者為雙鏈胰島素(胰島素)。單、雙鏈胰島素各含3對相同的二硫鍵：A鏈內(nèi)6位和11位間的1對二硫鍵A6-A11和A7-B7、A20-B19的2對A、B鏈間二硫鍵，它們的三維結(jié)構(gòu)也相同。單、雙鏈胰島素體外折疊機制研究的主要內(nèi)容為：捕捉折疊過程的中間體并對其分離純化、結(jié)構(gòu)分析，繼而提出體外折疊途徑。
1 單鏈胰島素的體外折疊
我們首先研究了單鏈胰島素——豬胰島素原(PIP) 的體外折疊。將完全還原/變性的豬胰島素前體加入到再折疊緩沖液中，于折疊過程中，捕捉到3個折疊中間體，經(jīng)分離純化、結(jié)構(gòu)分析，其中1個中間體含1對二硫鍵，命名為1SSPIP，2個中間體含2對二硫鍵，命名為2SSPIP。
進一步分析證明1SSPIP含A鏈內(nèi)二硫鍵[A6-A11]，雖然2個含2對二硫鍵的中間體2SSPIP 都含[A20-B19]二硫鍵，但是沒有捕捉到含1對二硫鍵[A20-B19]的中間體1SSPIP。推測1SS [A20-B19]PIP可能是一個短暫的過渡態(tài)中間體。為此我們用蛋白質(zhì)工程方法制備了具有[A20-B19]二硫鍵的模型肽[A20-B19]PIP，圓二色性光譜(CD) 等分析提示該中間體保留了部分折疊的構(gòu)象，它在體外折疊中能迅速、高效形成具有[A20-B19] 二硫鍵的PIP，推測這對二硫鍵產(chǎn)生于PIP 折疊的早期階段。我們繼而研究了人胰島素原(human proinsulin,HPI) 的體外折疊，捕捉到3個中間體，各含3對二硫鍵，除中間體P2含1對正確配對的二硫鍵SS[A20-B19] 外，其余全是非正確配對的二硫鍵。
此外，還研究了被認為是胰島素祖先分子的文昌魚類胰島素肽(amphioxus insulin-like peptide, AILP)的體外折疊，捕捉到4個中間體，各個中間體的二硫鍵對數(shù)和配對。
基于對上述單鏈胰島素在其體外折疊過程中，中間體的捕捉、分離純化、結(jié)構(gòu)分析，分別提出了PIP的體外折疊途徑、HPI的體外折疊途徑和AILP 的體外折疊途徑。
上述單鏈胰島素體外折疊的研究揭示了一些共同的折疊行為：首先，含[A20-B19]鏈間1對二硫鍵(1SS) 的中間體在體外折疊中非常重要，它形成于折疊的起始階段(initial stage)，是1 個短暫的過渡態(tài)中間體。在豬胰島素原PIP的折疊過程中，雖然沒有捕捉到1SS[A20-B19]PIP，但是在捕捉到的2個2SSPIP中間體都含有二硫鍵[A20-B19] ；人胰島素原HPI折疊中間體P2含有二硫鍵[A20-B19]；1SSAILP中間體的二硫鍵為[A20-B19]；用蛋白質(zhì)工程制備的[A20-B19]豬胰島素原PIP保留部分折疊構(gòu)象，且能在體外有效折疊。其次, 第二個二硫鍵的形成是可變通的(flexible)，且可由非天然二硫鍵重排成天然二硫鍵。
2 雙鏈胰島素的體外折疊
在雙鏈豬胰島素的體外折疊過程中，捕捉到6個中間體：2個A鏈中間體：P1A和P3A，4個B鏈中間體P2B、P4B、P5B 和P6B，未捕捉到集聚的A鏈或B鏈以及雙鏈中間體。
6個中間體分別與完全還原的A鏈或B鏈進行體外折疊，都能折疊成胰島素。實驗表明，中間體P1A和P5B是穩(wěn)定的，而中間體P3A和P4B則很活潑，A鏈的2個中間體P1A和P3A是可以相互轉(zhuǎn)換的；B鏈的4個中間體P2B、P4B、P5B和P6B也可以相互轉(zhuǎn)換。這6個中間體產(chǎn)生于胰島素體外折疊的早期階段。
基于6個中間體都能最終折疊成胰島素；1SSPIP是1個可捕捉到的含天然二硫鍵[A6-A11]的中間體；A鏈含4個半胱氨酸分別位于A6、A7、A11和A20，其中A6和A11形成A鏈內(nèi)二硫鍵[A6-A11]，A7和A20分別與B鏈形成2個鏈間二硫鍵：[A7-B7]和[A20-B19]。中間體P3A含1個鏈內(nèi)二硫鍵：[(A6，A7，A11)-A20]，是1個不穩(wěn)定的非天然二硫鍵，在折疊中P3A是1個很活潑的中間體。因此我們認為在相繼的折疊過程中，P3A通過半胱氨酸的-SH( 巰基)/ 二硫鍵交換形成更活潑的含天然二硫鍵[A6-A11]的過渡態(tài)中間體：([A6-A11]+A7-SH+A20-SH)A (T I)。中間體P4B的B7是半胱氨酸的-SH，P6B的B19是半胱氨酸的-SH，T I 一旦形成，它即與P4B和P6B識別并通過-SH/-SH之間的氧化作用，分別形成含2個天然二硫鍵的[A6-A11,A7-B8] 過渡態(tài)中間體(T II) 和[A6-A11,A20-B19] 過渡態(tài)中間體(T III)。過渡態(tài)中間體T I、T II、T III 存在非常短暫且非?；顫?，尚未捕捉到。由此我們提出雙鏈胰島素體外折疊途徑分為兩步：(1) 在折疊的早期階段，完全還原的胰島素形成6 個中間體，且最終都能折疊成胰島素；(2)在相繼的折疊過程中，P3A通過半胱氨酸的-SH/二硫鍵交換形成過渡態(tài)中間體T I，T I 進一步通過與P4B或P6B識別和半胱氨酸-SH和-SH 之間的氧化作用形成含有2個天然二硫鍵的過渡態(tài)中間體T II 和T III，T II 和T III 通過分子內(nèi)的半胱氨酸的-SH/二硫鍵的交換反應(yīng)迅速形成第3個二硫鍵，完成折疊。
以上表明雙鏈胰島素的體外折疊行為與單鏈胰島素有很大差異，兩者在一級結(jié)構(gòu)上的區(qū)別為：前者是A、B鏈由2對鏈間二硫鍵相連，后者除2對鏈間二硫鍵外，還通過‘C 肽’連結(jié)A、B 鏈為單一肽鏈。單鏈胰島素的C肽長短雖然不一，但都能在體外折疊成相同的3對二硫鍵和三維結(jié)構(gòu)。在完全還原/變性的條件下，單鏈胰島素的A、B鏈仍由C肽拉著，而雙鏈胰島素的A、B鏈則是斷了線的風(fēng)箏。故C肽的存在與否可能是導(dǎo)致單、雙鏈胰島素體外折疊行為差異的主要原因。
當(dāng)時我們考慮到，雙鏈胰島素體外折疊機制的研究，是“結(jié)晶胰島素全合成”的直接的后續(xù)工作，“結(jié)晶胰島素全合成”發(fā)表在《中國科學(xué)》，故也將其發(fā)表在《中國科學(xué)》。我們的上述工作得到了國際同行的認可和重視，2006年應(yīng)Antioxidannts &Redox Signaling (ARS) 雜志邀請于2008年在該雜志的10卷1期發(fā)表了“Forum Review: The in vitroOxidative Folding of the Insulin Superfamily”；2009年應(yīng)《Folding of Disulfide Proteins》書的編者邀請承擔(dān)了該書的一章，該書于2011年出版，其中第四章：In Vitro Folding of Single/Double Chain Insulinand Related Proteins 是我們寫的；根據(jù)ResearchGate 報告，截至2015年5 月初，我們十多年前關(guān)于胰島素方面的研究結(jié)果，仍然被科學(xué)家所關(guān)注，已有572次引用，1139次下載，4237次閱讀和713次Profile views。我們也希望與《生命科學(xué)》的讀者分享我們關(guān)于單、雙鏈胰島素的體外折疊的研究結(jié)果，以紀念“結(jié)晶胰島素全合成”50 周年。
（本文原發(fā)表于《生命科學(xué)》2015年第27卷第6期）