2月27日，國際學(xué)術(shù)期刊Nucleic Acids Research在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）吳立剛研究組聯(lián)合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院鄒琳研究員的最新研究成果：“Characterization of gRNA-dependent and gRNA-independent off-target binding sites of PspCas13b and RfxCas13d in mammalian cells”。該研究開發(fā)了檢測RNA結(jié)合蛋白（RBP）在RNA上結(jié)合位點(diǎn)的高靈敏、高信噪比深度測序方法uSpyCLIP，并運(yùn)用該技術(shù)揭示了兩種目前應(yīng)用最為廣泛的Cas13核酸酶——Prevotella sp. P5-125 (Psp)Cas13b和Ruminococcus flavefaciens XPD3002 (Rfx)Cas13d的gRNA依賴性以及gRNA非依賴性脫靶結(jié)合位點(diǎn)的特征，為未來RNA編輯、檢測和治療應(yīng)用中Cas13和gRNA的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供了寶貴的指導(dǎo)。
基于VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)的RNA編輯技術(shù)，因其結(jié)構(gòu)簡單且具備可編程的RNA靶向能力而備受關(guān)注。該系統(tǒng)可分為六種亞型，其中，PspCas13b和RfxCas13d的應(yīng)用最為普遍，已在多種細(xì)胞系和模式生物中成功實(shí)現(xiàn)對信使RNA（mRNA）及長鏈非編碼RNA（lncRNA）的敲低。更重要的是，切割活性喪失的dPspCas13b和dRfxCas13d變體可通過融合堿基編輯器或者其他功能蛋白用于RNA編輯、RNA成像以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等眾多領(lǐng)域，在疾病治療及核酸檢測中具有巨大的應(yīng)用潛力。因此，確保dCas13-gRNA系統(tǒng)的靶標(biāo)特異性變得尤為關(guān)鍵。然而，過往研究主要集中于對有限數(shù)量的候選脫靶位點(diǎn)開展體外切割活性檢測；盡管RNA深度測序可檢測轉(zhuǎn)錄組豐度變化，但僅局限于鑒定脫靶切割，無法提供無切割活性的dCas13-gRNA復(fù)合物無偏差、全轉(zhuǎn)錄組范圍的脫靶結(jié)合位點(diǎn)圖譜。這些局限性制約了對dCas13-gRNA復(fù)合物的靶標(biāo)特異性與識別規(guī)則的發(fā)現(xiàn)和分析。
紫外交聯(lián)與免疫沉淀（CLIP）是一種強(qiáng)大的技術(shù)，能夠以單堿基分辨率鑒定RNA結(jié)合蛋白（RBP）和核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物的直接RNA靶標(biāo)。在本研究中，研究人員開發(fā)出一種名為ultra SpyCLIP（uSpyCLIP）的技術(shù)。該技術(shù)通過最小化RBP融合標(biāo)簽設(shè)計(jì)，有效降低了對RBP活性的干擾，在識別RBP結(jié)合位點(diǎn)時兼具高靈敏性和出色的特異性，與其他類似方法相比可以在相同測序深度下檢測到更多的結(jié)合位點(diǎn)，并支持僅使用1000個細(xì)胞完成RBP結(jié)合位點(diǎn)圖譜測定。此外，uSpyCLIP技術(shù)完全依托磁珠進(jìn)行操作，便于實(shí)現(xiàn)自動化并減少人工投入，整個流程僅需兩天便可完成，是目前最高效的CLIP方法之一。
研究人員運(yùn)用uSpyCLIP技術(shù)，繪制出dPspCas13b-gRNA和dRfxCas13d-gRNA復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄組中的結(jié)合位點(diǎn)分布圖譜。研究顯示，dCas13的結(jié)合行為比先前預(yù)想的更為廣泛。兩種dCas13-gRNA復(fù)合物均呈現(xiàn)大量的脫靶結(jié)合事件。根據(jù)其是否依賴于gRNA，可以分為gRNA依賴性的（gRNA-dependent）脫靶和gRNA非依賴性的（gRNA-independent）脫靶。進(jìn)一步地，研究人員對兩種dCas13-gRNA復(fù)合物的脫靶結(jié)合行為進(jìn)行了表征和驗(yàn)證，證實(shí)dCas13蛋白的gRNA非依賴性脫靶位點(diǎn)具有獨(dú)特的RNA識別位點(diǎn)結(jié)構(gòu)和序列特征：dPspCas13b的脫靶結(jié)合與特定RNA結(jié)構(gòu)特征相關(guān)，而dRfxCas13d的脫靶結(jié)合則與特定的序列基序相關(guān)。對gRNA依賴性脫靶位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，gRNA的DR遠(yuǎn)端區(qū)和中部區(qū)域在決定結(jié)合特異性中的關(guān)鍵作用：PspCas13b gRNA間隔區(qū)前20個核苷酸中10個堿基的完全配對足以介導(dǎo)結(jié)合，而RfxCas13d gRNA間隔區(qū)第11-30個核苷酸中7個堿基的完全配對則足以介導(dǎo)結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，以上部分脫靶事件能夠?qū)е路前袠?biāo)基因的mRNA和/或蛋白質(zhì)水平基因表達(dá)發(fā)生變化。這些結(jié)果表明，基于dCas13或dCas13-效應(yīng)子融合蛋白的應(yīng)用，例如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、RNA成像和RNA編輯，可能會因脫靶結(jié)合而產(chǎn)生復(fù)雜的毒副作用。此項(xiàng)研究為檢測Cas13的脫靶結(jié)合位點(diǎn)提供了全新的技術(shù)手段與研究策略，深化了對Cas13系統(tǒng)的認(rèn)知，為特異性gRNA的合理設(shè)計(jì)以及Cas蛋白的工程改良提供了重要的理論基礎(chǔ)和支撐。
分子細(xì)胞卓越中心助理研究員馮歡歡和博士研究生李志學(xué)為該論文的共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心吳立剛研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院鄒琳研究員為該論文的共同通訊作者。該研究得到了分子細(xì)胞卓越中心細(xì)胞分析技術(shù)平臺、分子生物學(xué)技術(shù)平臺、生物信息學(xué)平臺和高性能計(jì)算存儲與網(wǎng)絡(luò)服務(wù)中心的大力支持，同時得到了中國科學(xué)院、國家自然科學(xué)基金委、科技部的經(jīng)費(fèi)支持。
文章鏈接：https://academic.oup.com/nar/article/54/4/gkag112/8494760
dPspCas13b-gRNA和dRfxCas13d-gRNA復(fù)合物脫靶結(jié)合位點(diǎn)的特征
