2月26日，國際學(xué)術(shù)期刊Cell Research在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）陳玲玲研究組和復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院/復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院楊力研究組的合作研究成果（Letter），題為“IRES–cargo interplay structurally modulates circular RNA translation”。該研究首次從結(jié)構(gòu)層面揭示，在環(huán)形RNA中，IRES序列與其驅(qū)動(dòng)的編碼序列（cargo）之間的相互作用會顯著影響IRES結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而調(diào)控環(huán)形RNA的翻譯效率。研究提出，IRES-cargo的相互作用是評估環(huán)形RNA翻譯能力的重要指標(biāo)，為理性設(shè)計(jì)高效翻譯性能的環(huán)形RNA分子奠定理論與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

?環(huán)形RNA是一類共價(jià)閉合的單鏈RNA，相比線性RNA更穩(wěn)定、免疫原性更低，具備特殊的空間構(gòu)象。工程化體外環(huán)化的RNA (in vitro circularized RNAs, ivcRNAs)，正在發(fā)展為極具潛力的新型RNA藥物平臺。近年來研究主要圍繞兩大方向：一是開發(fā)為RNA適配體，用于調(diào)控靶蛋白；二是用作蛋白質(zhì)翻譯載體，實(shí)現(xiàn)長效蛋白表達(dá)。然而，作為表達(dá)載體，環(huán)形RNA的翻譯效率受多種因素影響。由于其缺乏5’端帽子結(jié)構(gòu)，翻譯通常依賴病毒來源的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site, IRES）啟動(dòng)。但在環(huán)形RNA中，IRES結(jié)構(gòu)是否受編碼序列影響而改變功能，此前尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

研究人員基于高效的自剪接成環(huán)系統(tǒng)，構(gòu)建了攜帶不同病毒來源IRES和相同熒光素酶報(bào)告基因（firefly luciferase）的ivcRNAs。通過篩選45種IRES元件，發(fā)現(xiàn)第V類IRES（如Salivirus A IRES, SV-A）在多種細(xì)胞系中普遍表現(xiàn)出更高翻譯活性。然而，SV-A驅(qū)動(dòng)不同編碼序列（cargo，如mCherry、水痘-帶狀皰疹病毒截短包膜糖蛋白E (gE) 等）時(shí)，翻譯效率存在顯著差異。即使經(jīng)過密碼子優(yōu)化，某些cargo序列（如gE_jcat）在環(huán)形RNA中仍難以翻譯，但在線性mRNA中卻能高效翻譯，提示環(huán)形構(gòu)象可能改變SV-A的結(jié)構(gòu)。

為進(jìn)一步探究機(jī)制，團(tuán)隊(duì)利用in-cell circSHAPE-MaP技術(shù)，在活細(xì)胞中直接解析長鏈環(huán)形RNA的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)模型顯示，在高翻譯活性的ivc-SV-A-mCherry和ivc-SV-A-gE_pre中，SV-A形成完整二級結(jié)構(gòu)，包括關(guān)鍵的十字形結(jié)構(gòu)域IV；而在翻譯受阻的ivc-SV-A-gE_jcat中，該結(jié)構(gòu)域與gE_jcat序列發(fā)生廣泛堿基配對，導(dǎo)致十字形結(jié)構(gòu)被破壞。

為驗(yàn)證IRES與cargo之間不利的相互作用會損害IRES結(jié)構(gòu)并抑制翻譯，研究者在cargo區(qū)或IRES結(jié)構(gòu)域IV引入點(diǎn)突變，構(gòu)建不同突變類型的ivcRNAs。circSHAPE-MaP分析證實(shí)，突變成功阻斷了IRES與cargo間的堿基配對，恢復(fù)SV-A結(jié)構(gòu)域IV的十字形構(gòu)象。進(jìn)一步通過定量指標(biāo)（IRES crosstalk ratio和IRES structure consistency）量化SV-A結(jié)構(gòu)變化。最重要的，修復(fù)SV-A結(jié)構(gòu)后，gE蛋白表達(dá)完全或部分恢復(fù)，且表達(dá)水平與IRES結(jié)構(gòu)域IV的結(jié)構(gòu)完整性呈強(qiáng)正相關(guān)。

綜上，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)形RNA中，IRES元件的結(jié)構(gòu)折疊并非獨(dú)立存在，而是受到其驅(qū)動(dòng)的cargo序列的顯著影響。尤其是當(dāng)IRES與cargo之間發(fā)生不利的相互作用時(shí)，IRES的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域會被破壞，從而翻譯活性被抑制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量降低。因此，未來在工程化環(huán)形RNA的理性設(shè)計(jì)中，除了關(guān)注IRES本身的翻譯效率和cargo序列的密碼子優(yōu)化外，必須將IRES-cargo相互作用作為關(guān)鍵設(shè)計(jì)參數(shù)加以考量，通過避免或解除IRES與cargo之間的不利配對，確保IRES結(jié)構(gòu)的完整性，從而實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達(dá)，推動(dòng)環(huán)形RNA療法的臨床轉(zhuǎn)化。

分子細(xì)胞卓越中心副研究員黃友葵、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院博士研究生陳堯琦、分子細(xì)胞卓越中心博士研究生婁思雨、中國科學(xué)院大學(xué)杭州高等研究院博士后郜祥為論文共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心陳玲玲研究員和復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院/復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院楊力研究員為論文共同通訊作者。該項(xiàng)工作獲得科技部、中國科學(xué)院、上海市科委、上海市尚思科學(xué)研究院以及新基石科學(xué)基金會的經(jīng)費(fèi)支持，并得到分子細(xì)胞卓越中心細(xì)胞分析技術(shù)平臺，分子生物學(xué)技術(shù)平臺和細(xì)胞庫/干細(xì)胞技術(shù)平臺的幫助和支持。

文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-026-01233-9

?IRES-cargo的相互作用破壞IRES結(jié)構(gòu)完整性，進(jìn)而抑制ivcRNA蛋白表達(dá)，解開IRES-cargo之間的不利配對后恢復(fù)SV-A的高效翻譯能力