2月12日，國際學(xué)術(shù)期刊PNAS在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科盧潔研究組的合作研究成果，題為“Genetic recording of pancreatic beta cell proliferation”。該研究工作基于雙同源重組酶系統(tǒng)構(gòu)建了胰島beta細(xì)胞特異性ProTracer遺傳示蹤系統(tǒng)，可用于記錄生理穩(wěn)態(tài)及組織再生過程中的beta細(xì)胞增殖事件。相關(guān)研究成果揭示了胰腺穩(wěn)態(tài)維持、組織修復(fù)及再生過程中beta細(xì)胞的增殖動態(tài)變化規(guī)律，對于探索促進(jìn)胰島beta細(xì)胞再生的治療策略提供了重要理論依據(jù)與研究工具。

胰島beta細(xì)胞增殖是維持機(jī)體血糖代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其調(diào)控異常是糖尿病發(fā)生的核心機(jī)制之一。學(xué)界雖致力于篩選促beta細(xì)胞增殖的調(diào)控因子，但現(xiàn)有技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)beta細(xì)胞增殖的長期追蹤。傳統(tǒng)檢測方法如Ki67、pHH3免疫染色存在固有局限，Ki67-CreER遺傳示蹤僅能獲取單時(shí)間點(diǎn)靜態(tài)數(shù)據(jù)，無法捕捉長期增殖動態(tài)。因此，開發(fā)可靠靈敏的長期追蹤工具，對闡明胰島beta細(xì)胞增殖機(jī)制、研發(fā)糖尿病靶向療法至關(guān)重要。

在該項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先利用通用型ProTracer遺傳記錄系統(tǒng)（R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-RSR-LSL-tdT）研究胰島細(xì)胞增殖。該系統(tǒng)基于Cre與Dre雙重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)，經(jīng)他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)后，DreER進(jìn)入細(xì)胞核切割Ki67-CrexER (Ki67-Cre-rox-ER-rox)等位基因中rox序列側(cè)翼的ER片段，使CrexER轉(zhuǎn)化為組成型激活Cre；隨后Dre與Cre共同作用于報(bào)告基因，激活系統(tǒng)。理論上，單次Tam給藥即可使該系統(tǒng)在小鼠整個(gè)生命周期內(nèi)持續(xù)、無縫地捕捉并標(biāo)記體內(nèi)發(fā)生增殖的細(xì)胞。研究人員對成年P(guān)roTracer小鼠進(jìn)行Tam處理，并分別在給藥后4周、8周及12周收集胰腺組織，觀察到tdT?陽性beta細(xì)胞比例隨時(shí)間推移呈遞增趨勢，同時(shí)拓展分析至胰島alpha、delta、PP細(xì)胞等其他內(nèi)分泌細(xì)胞，均檢測到tdT陽性細(xì)胞比例的時(shí)間依賴性上升。

通用型ProTracer系統(tǒng)雖能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞增殖的長期追蹤，但不具備細(xì)胞類型特異性。因此，研究人員開發(fā)了beta細(xì)胞特異性ProTracer系統(tǒng)。該系統(tǒng)由Ins2-DreER、Ki67-CrexER及R26-RSR-LSL-tdT三種品系雜交構(gòu)建。DreER-rox重組可特異性激活beta細(xì)胞中的Ki67-Cre基因型，僅在Ins?Ki67?雙陽性細(xì)胞中表達(dá)tdT，實(shí)現(xiàn)beta細(xì)胞增殖過程的特異性示蹤。研究人員對成年beta細(xì)胞-ProTracer小鼠進(jìn)行Tam處理，不同時(shí)間點(diǎn)的胰腺組織分析顯示，tdT陽性beta細(xì)胞比例呈逐步上升趨勢。免疫染色證實(shí)絕大多數(shù)tdT陽性細(xì)胞為beta細(xì)胞，驗(yàn)證了系統(tǒng)的高特異性。團(tuán)隊(duì)還基于細(xì)胞周期基因Ccna2構(gòu)建了替代版本系統(tǒng)，檢測數(shù)據(jù)與Ki67系統(tǒng)高度相似，進(jìn)一步精準(zhǔn)量化了成年小鼠穩(wěn)態(tài)下beta細(xì)胞增殖速率。

為了探究增殖性beta細(xì)胞的分子特性及其潛在異質(zhì)性，研究團(tuán)隊(duì)從beta細(xì)胞特異性ProTracer小鼠體內(nèi)分離胰島細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）分析。聚類分析顯示beta細(xì)胞可分為4個(gè)具有不同轉(zhuǎn)錄特征的亞群，而tdT轉(zhuǎn)錄本在4個(gè)beta細(xì)胞亞群中呈均勻分布，提示增殖性beta細(xì)胞并不構(gòu)成獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄特征亞群。GO富集分析顯示tdT?細(xì)胞上調(diào)基因主要富集于核糖體生物發(fā)生及翻譯相關(guān)功能條目。tdT⁺ beta細(xì)胞中顯著上調(diào)的基因數(shù)量有限，這種微弱的轉(zhuǎn)錄差異與ProTracer系統(tǒng)的累積性記錄特性相符：該系統(tǒng)標(biāo)記的是整個(gè)示蹤窗口內(nèi)所有發(fā)生過增殖的細(xì)胞，而非僅在檢測時(shí)處于活躍分裂狀態(tài)的細(xì)胞。提示大多數(shù)增殖后的beta細(xì)胞在組織收集時(shí)其轉(zhuǎn)錄狀態(tài)已恢復(fù)至與非增殖beta細(xì)胞相似的水平。此外，研究團(tuán)隊(duì)采用克隆分析方法（Ins2-DreER;Ki67-CrexER;R26-Confetti）對增殖性beta細(xì)胞進(jìn)行研究，低劑量Tam處理后經(jīng)一段時(shí)間觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞克隆由單個(gè)細(xì)胞或成對細(xì)胞組成，并未觀察到由大量beta細(xì)胞構(gòu)成的克隆群，提示在示蹤周期內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞周期的beta細(xì)胞其后續(xù)增殖輸出能力不存在顯著異質(zhì)性。

為驗(yàn)證系統(tǒng)在損傷修復(fù)模型中的作用，團(tuán)隊(duì)對beta細(xì)胞-ProTracer小鼠實(shí)施胰腺部分切除術(shù)（PPX），與對照組小鼠相比，PPX組小鼠的tdT熒光信號顯著增強(qiáng)，表明該系統(tǒng)能夠有效捕捉PPX引發(fā)的beta細(xì)胞增殖增強(qiáng)效應(yīng)。藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，Tam處理后經(jīng)一段時(shí)間洗脫期，對小鼠每日腹腔注射哈馬靈（DYRK1A抑制劑）與GW788388（TGFbeta超家族抑制劑）聯(lián)用藥物，結(jié)果顯示處理組tdT陽性beta細(xì)胞比例顯著高于對照組，證實(shí)該系統(tǒng)可準(zhǔn)確檢測藥物誘導(dǎo)的增殖變化，具備藥物篩選潛力。針對胰腺導(dǎo)管結(jié)扎術(shù)（PDL）對beta細(xì)胞增殖的影響爭議，團(tuán)隊(duì)對小鼠實(shí)施PDL后，對比損傷尾部與對照頭部的tdT陽性beta細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)無顯著差異，表明PDL未明顯促進(jìn)beta細(xì)胞增殖。

總體而言，本研究基于雙重組酶系統(tǒng)構(gòu)建了beta細(xì)胞-ProTracer遺傳示蹤系統(tǒng)，可用于記錄生理穩(wěn)態(tài)及組織再生過程中的beta細(xì)胞增殖事件。本研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)條件下，beta細(xì)胞增殖事件隨時(shí)間推移逐漸增多，并且增殖性beta細(xì)胞的增殖潛能具有均一性。本研究通過PPX與藥物刺激兩種方式驗(yàn)證了ProTracer系統(tǒng)在beta細(xì)胞增殖監(jiān)測中的功能應(yīng)用，證實(shí)了該系統(tǒng)在量化beta細(xì)胞增殖水平方面的有效性，同時(shí)明確PDL對beta細(xì)胞增殖并無顯著促進(jìn)作用。該系統(tǒng)為beta細(xì)胞增殖研究提供了重要工具，有望推動胰腺再生及糖尿病治療策略的發(fā)展。

分子細(xì)胞卓越中心副研究員趙歡、博士生陳惠和國科大杭州高等研究院博士后康志鑫為該論文共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心周斌研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院盧潔教授為該論文共同通訊作者。該研究得到分子細(xì)胞卓越中心動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺、細(xì)胞分析技術(shù)平臺和南模生物的大力支持和幫助。該工作得到中國科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委、新基石科學(xué)基金會和賽諾菲優(yōu)秀青年人才獎勵基金等支持。

文章鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2507877123

通用型ProTracer與beta細(xì)胞-ProTracer遺傳示蹤系統(tǒng)的建立