嵌合性抗原受體(Chimeric antigen receptor, CAR)是一種人工合成的免疫受體，整合了抗體的抗原識別區(qū)、T細(xì)胞抗原受體(T?cell receptor, TCR)的信號區(qū)以及共刺激分子的信號區(qū)。利用基因工程方法在T細(xì)胞中外源表達(dá)CAR后，產(chǎn)生的CAR?T細(xì)胞可以針對特定抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。CAR?T細(xì)胞治療已獲批應(yīng)用于腫瘤治療領(lǐng)域，并且在自身免疫病中也展示了很好的應(yīng)用前景，未來還可以應(yīng)用于感染、器官纖維化、衰老等多種場景。與天然的受體TCR相比，CAR的抗原敏感性差，并且與其它信號分子的協(xié)同性差。這些劣勢是因為CAR無法像TCR一樣形成成熟的免疫突觸來整合各條信號通路。這些信號的劣勢會導(dǎo)致CAR?T細(xì)胞無法清除抗原表達(dá)量低的靶細(xì)胞，并且容易發(fā)生功能耗竭，無法長期工作。優(yōu)化CAR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能是突破當(dāng)前CAR T細(xì)胞治療臨床瓶頸的關(guān)鍵所在。

11月27日，國際學(xué)術(shù)期刊Immunity在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)許琛琦研究組聯(lián)合上?？萍即髮W(xué)王皞鵬研究組的最新合作成果：“Phase?separation of chimeric antigen receptor promotes immunological synapse?maturation and persistent?cytotoxicity”。該研究在傳統(tǒng)二代CAR分子胞內(nèi)段引入TCR中的CD3ε元件(E-CAR)，并且對CD3ε進(jìn)行了序列優(yōu)化，提高E-CAR在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。E-CAR分子可以通過cation-pi相互作用產(chǎn)生液液相分離，幫助免疫突觸的形成與成熟；這不僅增強(qiáng)了E-CAR分子本身的信號功能，也能招募CD2等共刺激分子，更好地利用內(nèi)源共刺激信號。E-CAR?T細(xì)胞比普通的CAR?T細(xì)胞具有更高的抗原敏感性，以及更好的持續(xù)殺傷能力，在初發(fā)腫瘤和復(fù)發(fā)腫瘤的動物模型中，展示了更好的抗腫瘤功能。當(dāng)前，E-CAR已進(jìn)入臨床試驗階段，展示了很好的應(yīng)用前景。

CD3ε信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

大多數(shù)T細(xì)胞的TCR主要由抗原識別亞基TCRαβ和信號傳遞亞基CD3εδ，CD3εγ，CD3ζζ組成。CD3分子富含多處功能序列，可以結(jié)合不同信號分子，發(fā)揮各種調(diào)控功能。其中，CD3ε分子的N端是一段堿性氨基酸富集區(qū)(Basic amino?acid-rich sequence,BRS)，緊接著是一段脯氨酸富集區(qū)(Proline-rich sequence，PRS)，C端則由一段包含RK序列的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor activation tyrosine-based motif，ITAM)組成。許琛琦團(tuán)隊及其合作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)T細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，BRS與細(xì)胞質(zhì)膜的酸性磷脂發(fā)生靜電相互作用，將CD3ε的胞內(nèi)區(qū)屏蔽在膜內(nèi)，防止T細(xì)胞產(chǎn)生過強(qiáng)的基底信號(Xu?et al., Cell 2008)；抗原刺激TCR后，鈣離子大量內(nèi)流，中和酸性磷脂的負(fù)電荷，從而打破BRS和酸性磷脂的靜電相互作用，釋放CD3ε胞內(nèi)區(qū)(Shi?et al., Nature 2013)；CD3ε?BRS隨后和酪氨酸激酶LCK發(fā)生靜電相互作用，促進(jìn)TCR-LCK的液液相分離，增強(qiáng)TCR的磷酸化，并進(jìn)一步促進(jìn)LCK的活化(Chen et al., PNAS?2023)。磷酸化的CD3ε ITAM可以招募抑制性激酶CSK，抑制LCK活性，并打破TCR-LCK相分離，使得TCR信號回歸基線，防止細(xì)胞過度活化(Wu et?al., Cell 2020)?；谶@些研究成果，許琛琦團(tuán)隊于2024年榮獲國家自然科學(xué)二等獎。

許琛琦團(tuán)隊進(jìn)而將CD3ε引入二代CAR分子，設(shè)計出了在功能上更加模擬TCR的第一代E-CAR。在本研究中，團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)E-CAR?1.0的胞內(nèi)信號區(qū)自身就能夠形成液液相分離，而傳統(tǒng)二代CAR分子的相分離現(xiàn)象較弱。這種相分離主要由CD3ε的堿性氨基酸和其它信號區(qū)上的酪氨酸所帶的pi電子形成的cation-pi相互作用所介導(dǎo)。在細(xì)胞水平，E-CAR?1.0更易于在細(xì)胞表面聚集，然而E-CAR在膜上的表達(dá)水平比傳統(tǒng)CAR低。因此，研究團(tuán)隊通過蛋白序列優(yōu)化，構(gòu)建了一種E-CAR?2.0版本(B6I)，在保留其相分離所需堿性氨基酸的基礎(chǔ)上，有效地提高了膜表達(dá)水平。

免疫突觸

T細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸時形成高度有序的超分子激活簇(Supramolecular activation cluster，SMAC)，成熟的TCR免疫突觸通常是具有“牛眼“樣結(jié)構(gòu)，由TCR形成的central SMAC(cSMAC)，由黏附分子LFA-1形成的peripheral?SMAC(pSMAC)和富含磷酸酶CD45的distal?SMAC(dSMAC)組成。pSMAC和dSMAC之間還有共刺激受體CD2形成的花冠結(jié)構(gòu)，富含CD28，ICOS等多種共刺激分子和PD-1等共抑制受體，共同調(diào)控T細(xì)胞信號。多層有序的免疫突觸結(jié)構(gòu)確保了信號的有效傳遞。很多研究表明CAR分子不能形成經(jīng)典的免疫突觸結(jié)構(gòu)，CAR分子形成的通常是不規(guī)則的微簇結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致其對抗原信號傳遞低效和對共刺激信號利用不足(Gudipati??et al., Nat Immunol 2020；Burton et al., PNAS 2023；Dong et al., EMBO J?2020)。與TCR相比，傳統(tǒng)CAR分子只利用了CD3ζ鏈作為其主要信號傳遞亞基。其余CD3鏈的缺失可能導(dǎo)致CAR無法形成成熟的免疫突觸。

由于抗原受體聚集是免疫突觸形成的基礎(chǔ)，E-CAR相分離促進(jìn)了免疫突觸成熟，不僅提升了E-CAR在cSMAC中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，還在外周形成更好的CD2花冠結(jié)構(gòu)，招募PI3K這些信號分子來介導(dǎo)共刺激信號。團(tuán)隊還注意到，E-CAR免疫突觸呈現(xiàn)出信號先放大后減弱的動態(tài)性，與TCR形成的免疫突觸非常相似。

E-CAR功能優(yōu)勢

團(tuán)隊隨后對E-CAR T細(xì)胞的功能展開了研究，發(fā)現(xiàn)其對弱抗原腫瘤細(xì)胞的結(jié)合與殺傷都更強(qiáng)。通過建立腫瘤細(xì)胞反復(fù)刺激模型，團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)E-CAR?T細(xì)胞的長效殺傷效果更好，在清除腫瘤細(xì)胞的同時還可維持自我增殖。RNA測序結(jié)果顯示E-CAR?T細(xì)胞可以利用CD2信號來緩解功能耗竭，這與其能誘導(dǎo)形成CD2花冠結(jié)構(gòu)這一現(xiàn)象吻合。在血液瘤和實(shí)體瘤的初發(fā)腫瘤動物模型以及血液瘤復(fù)發(fā)的動物模型中，E-CAR?T細(xì)胞都比傳統(tǒng)的細(xì)胞表現(xiàn)出了更好的抗腫瘤效果。

綜上所述，這一研究通過蛋白設(shè)計，構(gòu)建了可相分離的新型E-CAR分子，提高了免疫突觸質(zhì)量，從而提高了抗原敏感性和細(xì)胞持續(xù)性，在動物模型中取得了良好的疾病治療效果。

分子細(xì)胞卓越中心許琛琦研究員和上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王皞鵬研究員為該論文的共同通訊作者。分子細(xì)胞卓越中心博士研究生徐心怡，上?？萍即髮W(xué)與分子細(xì)胞卓越中心聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生陳昊天，分子細(xì)胞卓越中心博士研究生任正旭，國科大杭州高等研究院碩士研究生徐曉敏為該論文共同第一作者。該研究獲國家自然科學(xué)基金委、科技部重點(diǎn)研發(fā)計劃、中國科學(xué)院青年團(tuán)隊、上海市科委等項目資助。該研究得到分子細(xì)胞卓越中心動物實(shí)驗技術(shù)平臺、細(xì)胞分析技術(shù)平臺和分子生物學(xué)技術(shù)平臺的大力支持。

文章鏈接：https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(24)00520-X?

相分離E-CAR促進(jìn)T細(xì)胞免疫突觸成熟，從而提高抗原敏感性和細(xì)胞長效性