北京時(shí)間10月4日，國際學(xué)術(shù)期刊Cell在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組的最新成果“Identifying specific functional roles for senescence across cell types”。該研究基于雙同源重組酶系統(tǒng)建立了體內(nèi)細(xì)胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術(shù)，系統(tǒng)探討了肝臟損傷和修復(fù)過程中不同細(xì)胞類型衰老細(xì)胞的命運(yùn)軌跡及其特定作用。這一研究工作不僅為肝臟疾病的臨床治療提供新的研究方向和理論依據(jù)，也為細(xì)胞衰老領(lǐng)域和再生醫(yī)學(xué)研究提供了新的技術(shù)路徑與方法。

細(xì)胞衰老這一概念最初由Leonard Hayflick及其同事于1961年提出，其在胚胎發(fā)育、癌癥、衰老和其他多種疾病等生理病理過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞衰老具有多種特征，包括細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制蛋白（如?p16^Ink4a、p21^CIP1）的表達(dá)、衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性升高，以及衰老相關(guān)分泌表型（SASP，包括一系列趨化因子、白細(xì)胞介素、生長因子或組織重塑蛋白酶等）的顯現(xiàn)。精準(zhǔn)靶向體內(nèi)的衰老細(xì)胞對于揭示其在衰老和各種病理狀況中的機(jī)理作用至關(guān)重要。目前，p16^Ink4a是研究細(xì)胞衰老廣泛使用的標(biāo)志物之一，它在抑制CDK4/6活性和限制細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。眾多研究利用p16^Ink4a的表達(dá)來識別體內(nèi)的衰老細(xì)胞，并構(gòu)建了多種基于p16^Ink4a的遺傳小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，在年輕和健康組織中基本上檢測不到p16^Ink4a的表達(dá)，但在衰老或損傷組織中會(huì)積累p16^Ink4a+細(xì)胞，通過遺傳或藥物方法消除p16^Ink4a+細(xì)胞，可以延長早衰小鼠的壽命，減輕生理衰老小鼠的年齡相關(guān)表型，并改善多種疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、肺纖維化、糖尿病、肝脂肪變性以及腫瘤發(fā)生等。然而，也有研究表明，衰老細(xì)胞在某些情況下可能發(fā)揮積極作用，如腫瘤抑制、胚胎發(fā)育、傷口愈合、毛發(fā)生長、促進(jìn)肺再生等。然而，目前的衰老細(xì)胞功能研究都是非特異性地針對所有衰老細(xì)胞，而不考慮細(xì)胞類型，這使得特定細(xì)胞類型衰老細(xì)胞的命運(yùn)軌跡和生理病理作用尚不清楚。為了解決這一科學(xué)問題，周斌組建立體內(nèi)細(xì)胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術(shù)，揭示體內(nèi)細(xì)胞衰老的命運(yùn)軌跡和特定功能。

研究人員首先構(gòu)建了一種熒光報(bào)告基因小鼠品系p16-tdT，通過檢測不同年齡段各器官中tdT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)tdT⁺細(xì)胞在不同器官中的類型多樣且比例隨著年齡的增長顯著增加。同時(shí)，這些tdT⁺細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的SA-β-Gal活性、更低的增殖能力及高表達(dá)SASP因子等，進(jìn)一步驗(yàn)證了p16^Ink4a+細(xì)胞的細(xì)胞衰老表型。

肝纖維化是成纖維細(xì)胞活化的結(jié)果，其特點(diǎn)是成纖維細(xì)胞增殖增加和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。細(xì)胞衰老與肝纖維化有相關(guān)性，但在如此復(fù)雜的病理生理背景下，衰老細(xì)胞的細(xì)胞動(dòng)態(tài)和具體作用機(jī)制仍不清楚。針對肝纖維化這一特定病理過程，研究人員利用四氯化碳（CCl₄）誘導(dǎo)的肝臟損傷模型，結(jié)合免疫染色與單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)肝損傷中p16^Ink4a+細(xì)胞主要涉及內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。通過基因表達(dá)譜分析，研究人員發(fā)現(xiàn)這些p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的基因表達(dá)變化，包括SASP因子的表達(dá)和細(xì)胞衰老相關(guān)信號通路上調(diào)等。

為了進(jìn)一步研究細(xì)胞類型特異性p16^Ink4a+細(xì)胞在肝損傷和修復(fù)中的命運(yùn)，研究人員開發(fā)了一種名為Sn-pTracer（senescent cells-pulse-chase-tracer）的遺傳系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用了雙重組酶技術(shù)，只有在共同表達(dá)Dre和Cre重組酶的細(xì)胞中，R26-RL-tdT（Rosa26-rox-Stop-rox-loxP-Stop-loxP-tdT）報(bào)告小鼠的兩個(gè)Stop序列才會(huì)被移除，從而誘導(dǎo)tdT的表達(dá)。研究人員將巨噬細(xì)胞特異性F4/80-Dre或內(nèi)皮細(xì)胞特異性Cdh5-DreER小鼠品系與p16-CreER和R26-RL-tdT小鼠交配，產(chǎn)生了F4/80-Dre;p16-CreER;R26-RL-tdT小鼠命名為SnM?-pTracer，和Cdh5-DreER;p16-CreER;R26-RL-tdT小鼠命名為SnEC-pTracer。在CCl₄誘導(dǎo)的肝損傷中，SnM?-pTracer和SnEC-pTracer系統(tǒng)分別精確標(biāo)記了p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞與p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，損傷肝臟的p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞顯著增多但修復(fù)后大量凋亡，被p16^Ink4a–巨噬細(xì)胞替代。相反，p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞在損傷后雖也增加，但在肝臟修復(fù)階段大部分存活，表明其衰老狀態(tài)對內(nèi)皮細(xì)胞而言可能是可逆的細(xì)胞周期停滯。這些發(fā)現(xiàn)揭示了不同類型細(xì)胞在應(yīng)對肝損傷時(shí)不同的衰老與修復(fù)機(jī)制，為深入理解細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控及組織修復(fù)策略提供了新視角。

然而，使用Sn-pTracer系統(tǒng)需要研究人員具有細(xì)胞類型特異性的Dre工具小鼠，相對Cre工具小鼠數(shù)量還是比較少。此外，考慮到tamoxifen（Tam）在體內(nèi)的血清半衰期較短，在損傷期間對Sn-pTracer小鼠持續(xù)使用Tam誘導(dǎo)以記錄細(xì)胞衰老不僅是一種負(fù)擔(dān)，而且可能對小鼠健康有害。為了克服這些限制，研究人員開發(fā)了一種新的遺傳系統(tǒng)，命名為Sn-cTracer（senescent cells-Cre-induced-tracer），通過細(xì)胞類型特異性Cre啟動(dòng)持續(xù)記錄p16^Ink4a+細(xì)胞，從而使其更廣泛地應(yīng)用于體內(nèi)p16^Ink4a+細(xì)胞特異性靶向。根據(jù)設(shè)計(jì)，Sn-cTracer?涉及三種小鼠品系：細(xì)胞類型特異性Cre（ER）工具小鼠、p16-LSL-Dre（p16-loxP-Stop-loxP-Dre）和R26-RL-tdT-DTR（Rosa26-rox-Stop-roxP-Stop-loxP-tdT-DTR）。Cre-loxP重組可切除p16-LSL-Dre的Stop序列，從而在Cre表達(dá)細(xì)胞中將p16-LSL-Dre轉(zhuǎn)化為p16-Dre，并且只有同時(shí)表達(dá)Dre和Cre的細(xì)胞才能移除R26-RL-tdT-DTR等位基因中的兩個(gè)Stop序列，從而永久表達(dá)tdT和DTR（白喉毒素受體），實(shí)現(xiàn)以細(xì)胞類型特異性的方式對p16^Ink4a+細(xì)胞進(jìn)行不間斷記錄和遺傳清除。在實(shí)驗(yàn)中，研究人員構(gòu)建了SnM?-cTracer小鼠，用于探究p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的作用。CCl₄誘導(dǎo)肝纖維化損傷過程中，利用白喉毒素（DT）特異性清除這些細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其顯著減輕了纖維化程度，揭示了p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞在纖維化過程中的促進(jìn)作用(圖1)。為進(jìn)一步理解不同類型細(xì)胞在纖維化中的作用，研究人員還構(gòu)建了SnEC-cTracer小鼠，聚焦于p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞。與p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞相反，特異性清除p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞后肝臟纖維化程度加劇，表明這些細(xì)胞在限制肝損傷和纖維化過程中發(fā)揮重要作用。Sn-cTracer系統(tǒng)不僅簡化了實(shí)驗(yàn)流程，還提供了強(qiáng)有力的遺傳工具來精準(zhǔn)操控和解析p16^Ink4a+細(xì)胞在復(fù)雜生理病理過程中的具體作用。

為了深入理解p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在肝纖維化中的不同作用機(jī)制，研究人員采用scRNA-seq技術(shù)對SnM?-cTracer和SnEC-cTracer小鼠的肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了深入分析。在SnM?-cTracer小鼠中，DT處理顯著改變了巨噬細(xì)胞群體的基因表達(dá)譜，上調(diào)了與免疫激活相關(guān)的通路，如促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和T淋巴細(xì)胞增殖，這提示清除p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞限制肝纖維化可能是通過改變了肝臟免疫微環(huán)境導(dǎo)致的。相比之下，SnEC-cTracer小鼠中DT處理導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞比例上升，表明肝纖維化加劇。內(nèi)皮細(xì)胞群體的基因表達(dá)變化揭示了清除p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞后，肝組織向促纖維化環(huán)境轉(zhuǎn)變，成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞增殖增強(qiáng)，提示p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞抑制成纖維細(xì)胞增殖的重要作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了兩種細(xì)胞類型在肝纖維化中的不同作用機(jī)制，也為開發(fā)針對肝纖維化的精準(zhǔn)治療策略提供了新的見解。

通過RNA-Seq分析，研究人員發(fā)現(xiàn)在血管生成與肝臟修復(fù)中發(fā)揮重要作用的VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體Kdr表達(dá)在p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞中有下調(diào)趨勢。鑒于VEGF信號對內(nèi)皮功能及肝臟健康的關(guān)鍵作用，研究人員開發(fā)了Sn-gTracer系統(tǒng)（senescent cells-gene manipulation-tracer），旨在細(xì)胞類型特異性地調(diào)控p16^Ink4a+細(xì)胞中基因表達(dá)。根據(jù)設(shè)計(jì)，Tam誘導(dǎo)的Cdh5-DreER（用于確定細(xì)胞類型，在本例中為內(nèi)皮細(xì)胞）將內(nèi)皮細(xì)胞中p16-CreXER（p16-Cre-rox-ER-rox）轉(zhuǎn)換為p16-Cre，隨后實(shí)現(xiàn)靶向任何Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的等位基因敲除或者過表達(dá)，同時(shí)允許表達(dá)Cre介導(dǎo)的報(bào)告基因來示蹤細(xì)胞類型特異性衰老細(xì)胞。研究人員利用SnEC-gTracer系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了在p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞中Kdr的過表達(dá)。在肝纖維化模型中，SnEC-gTracer小鼠肝臟內(nèi)具有較多mCherry⁺內(nèi)皮細(xì)胞，并伴隨EdU結(jié)合陽性，表明具有一定的細(xì)胞增殖能力，同時(shí)SASP因子表達(dá)減弱。更重要的是，纖維化標(biāo)記物免疫熒光染色及天狼星紅染色結(jié)果均顯示，Kdr過表達(dá)顯著減輕了肝纖維化程度。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞在肝纖維化中的新角色，還展示了通過遺傳重編程改善肝臟損傷的巨大潛力，為肝纖維化治療提供了新的策略與希望。

綜上，細(xì)胞類型特異性p16^Ink4a+細(xì)胞的精準(zhǔn)遺傳靶向是揭示其在衰老與疾病中功能的關(guān)鍵，研究人員建立了體內(nèi)細(xì)胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術(shù)，開發(fā)了四種互補(bǔ)的遺傳策略，研究不同細(xì)胞類型中p16^Ink4a+衰老細(xì)胞的體內(nèi)命運(yùn)與特定功能，不僅為細(xì)胞衰老與損傷再生的研究提供了新的視角和工具，也為未來精準(zhǔn)靶向細(xì)胞衰老療法奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組副研究員趙歡、博士生劉子鑫和博士生陳惠為該論文共同第一作者。周斌研究員為該論文通訊作者。該研究得到瑞士諾華制藥Jan Tchorz博士、江南大學(xué)馬鑫教授、阿斯利康Qing-Dong Wang博士、上海動(dòng)物中心沈如凌博士、南模生物孫瑞林博士和王津津博士、勃林格殷格翰公司Markus Werner, Michael Meister, Stefan Kauschk等支持和幫助，以及分子細(xì)胞卓越中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)、細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)、分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)、化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)及中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)的大力支持。該工作得到中國科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委、新基石科學(xué)基金會(huì)等支持。

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利用體內(nèi)細(xì)胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術(shù)揭示不同細(xì)胞類型衰老細(xì)胞特定功能