7月4日，國際學術期刊Nature Methods在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）陳玲玲研究組關于CRISPR-dCas12a應用于DNA活細胞標記的最新研究進展：“CRISPR array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells”。該研究對現(xiàn)有的CRISPR-dCas12a系統(tǒng)進行了篩選優(yōu)化，構建了可用于非重復序列DNA活細胞成像的CRISPRdelight系統(tǒng)；進一步利用CRISPRdelight系統(tǒng)揭示了基因位點在細胞核內(nèi)的定位與其運動能力和轉錄活性的相關性；同時利用RNA適配體修飾的CRISPR串聯(lián)序列實現(xiàn)了對4種衛(wèi)星DNA的活細胞多色成像。
活細胞追蹤DNA、RNA等核酸的空間分布和動態(tài)變化對于了解基因表達調(diào)控機制具有十分重要的意義。CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種來源于細菌和古細菌體內(nèi)的獲得性免疫系統(tǒng)，由于其特異性靶向DNA/RNA的能力，已被廣泛開發(fā)成多種細胞內(nèi)DNA/RNA的遺傳操作和檢測標記的工具。陳玲玲研究組前期構建了基于CRISPR-dCas13的RNA標記系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了對活細胞和斑馬魚胚胎內(nèi)RNA的成像追蹤，以及活細胞RNA多色成像(Yang et al., Mol Cell, 2019; Huang et al., Genome Bio, 2023; Yang et al., Cell Insight, 2022)。此外，經(jīng)過改造的靶向DNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可用于活細胞DNA成像標記(Chen et al., Cell, 2013; Ma et al., Nat Biotechnol, 2016)。這些CRISPR系統(tǒng)在標記內(nèi)源核酸序列方面顯示出獨特的優(yōu)勢，然而對于非重復DNA/RNA序列的活細胞特異性成像目前仍存在著諸多限制。
CRISPR-Cas12a系統(tǒng)屬于類型V的CRISPR-Cas家族，在靶向DNA的同時還具備將CRISPR串聯(lián)序列加工成多條成熟crRNA的能力（Zetsche, B. et al., Cell, 2015）。因此，CRISPR-Cas12a系統(tǒng)理論上可以通過CRISPR串聯(lián)序列在同一細胞內(nèi)表達足夠數(shù)量的crRNA，從而實現(xiàn)對非重復序列DNA的標記。
為了驗證這一假設，研究人員選取了三種已報道的能顯著提高基因編輯效率的dLbCas12a突變體，并對它們在標記微衛(wèi)星DNA Sat I和Sat III方面的能力進行了比較。結果顯示，hyperdLbCas12a突變體（D156R，D235R，D292R，D350R）可以實現(xiàn)更高的標記效率和信號質(zhì)量。研究人員進一步發(fā)現(xiàn)hyperdLbCas12a可以加工CRISPR串聯(lián)序列，并維持與直接表達成熟crRNA近似的DNA標記能力，同時篩選出了能夠表達長達50次crRNA重復序列的CAG啟動子，并基于此構建了用于活細胞DNA成像的CRISPRdelight系統(tǒng)。
研究人員針對CCAT1轉錄起始位點上游10kb的區(qū)域設計了48條gRNA，使用CRISPRdelight系統(tǒng)成功實現(xiàn)了CCAT1基因位點的活細胞標記。以同樣的方式，CRISPRdelight系統(tǒng)在其他6個非重復序列基因位點均得到了有效驗證，并且該系統(tǒng)在HCT116、U2OS以及小鼠胚胎干細胞（R1）中同樣有效。CRISPRdelight系統(tǒng)相較于之前報道的基于CRISPR-dCas9的CARGO活細胞標記系統(tǒng)（Gu, B. et al.，Science, 2018），具有質(zhì)粒構建成本低、周期短、可表達gRNA數(shù)量多、標記系統(tǒng)組成更簡潔等多方面優(yōu)點。
研究人員利用CRISPRdelight系統(tǒng)進一步分析了CCAT1在細胞核內(nèi)的分布特點和運動特征。研究結果顯示，位于細胞核膜處Lamin蛋白層的CCAT1位點運動能力明顯弱于位于細胞核內(nèi)的CCAT1位點；進一步檢測CCAT1的內(nèi)含子表達信號，發(fā)現(xiàn)Lamin蛋白層的CCAT1位點轉錄活性也更弱。同時，研究人員對HSPH1、HSPA1A等熱休克基因進行了標記，在向細胞施加42°C或亞砷酸鈉刺激后，發(fā)現(xiàn)定位于核斑的HSPH1基因位點會明顯增多，并且位于核斑的基因位點轉錄活性也明顯更強。這些結果表明了基因組DNA的細胞核內(nèi)空間位置與其運動能力和表達活性的相關性。
最后，研究人員通過RNA結構優(yōu)化，成功將BoxB、Pepper、PP7和MS2 等RNA適配子元件插入至gRNA中，利用CRISPRdelight系統(tǒng)和這些元件對應的融合熒光蛋白，實現(xiàn)了微衛(wèi)星DNA Sat I、Sat II、Sat III和Sat α的活細胞四色標記。CRISPRdelight系統(tǒng)為研究活細胞中DNA位點的空間位置和動力學特征，提供了更簡單和便利的新手段。
分子細胞卓越中心楊良中博士（已畢業(yè)）、敏逸暉碩士和劉昱昕博士為該論文的共同第一作者，陳玲玲研究員為通訊作者。該項工作得到霍華德休斯醫(yī)學研究所Zhe (James) Liu教授、復旦大學生物醫(yī)學研究院/復旦大學附屬兒科醫(yī)院楊力研究員、清華大學王海峰博士的大力支持。該研究獲得分子細胞卓越中心細胞分析技術平臺的技術支持，并獲國家自然科學基金、科技部、中國科學院及上海市科委的基金支持。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02333-3
CRISPRdelight系統(tǒng)能夠有效標記多個基因組非重復DNA位點。向gRNA中插入不同的RNA適配子后，CRISPRdelight系統(tǒng)能實現(xiàn)多個基因組位點的活細胞多色成像。
