北京時間4月4日，國際學術期刊Cell在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌研究組的最新成果“Tracing the origin of alveolar stem cells in lung repair and regeneration”。該研究建立了追蹤肺上皮細胞的Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組酶介導的遺傳譜系示蹤新技術，結合多種小鼠肺臟損傷模型，系統(tǒng)研究了肺泡上皮干細胞的再生起源并揭示其細胞命運調(diào)控的分子機制。該工作不僅為肺臟疾病的臨床治療研究提供了新的科學依據(jù)和突破口，也為器官發(fā)育和再生醫(yī)學研究提供了新技術和新方法。
肺作為一個復雜的多功能器官，對人類生存至關重要。肺上皮干細胞在肺臟再生修復中發(fā)揮重要作用，是肺臟再生和肺疾病領域的研究熱點。以小鼠肺臟為例，肺葉內(nèi)部主要包括支氣管和肺泡兩個區(qū)域。不同區(qū)域的肺上皮細胞種類和數(shù)目不同，并且含有各自的干細胞負責本區(qū)域上皮的穩(wěn)態(tài)維持及損傷修復。支氣管上皮主要由棒狀細胞（Club cell，分子標記為Scgb1a1）、纖毛細胞（Ciliated cell）和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞（Neuroendocrine cell, NE cell）等細胞構成，其中Club細胞和NE細胞屬于干細胞，能維持支氣管上皮更新；肺泡上皮主要由I型肺泡上皮細胞（Alveolar type I cell, AT1 cell）和II型肺泡上皮細胞（Alveolar type II cell, AT2 cell，分子標記為Sftpc）構成，其中AT2細胞作為肺泡干細胞能自我更新并分化為AT1細胞；在支氣管和肺泡區(qū)域交界的位置，還存在一群支氣管肺泡干細胞（Bronchioalveolar stem cells, BASCs），具有同時表達club細胞分子標記Scgb1a1和AT2細胞分子標記Sftpc的特點，周斌團隊前期研究揭示了BASCs在肺損傷后具有向支氣管和肺泡上皮雙向分化的潛能。
AT2細胞作為肺泡上皮干細胞在肺泡損傷修復中發(fā)揮重要作用。因此鑒定和闡明AT2肺泡干細胞的再生起源及分子調(diào)控機制對肺臟疾病的治療具有重要意義。近年來陸續(xù)有重要研究成果報道，發(fā)現(xiàn)在肺臟受損后，AT2細胞除了來源于自我更新外，還會起源于AT1細胞和club細胞，這些關于肺臟干細胞突破性的研究發(fā)現(xiàn)，極大推進了肺臟再生領域的發(fā)展。然而由于肺干細胞研究領域內(nèi)廣泛使用的傳統(tǒng)譜系示蹤技術存在非特異性標記的缺陷，導致這些重大發(fā)現(xiàn)一直存在科學爭議，因此亟需構建譜系示蹤新技術對這些科學爭議一一進行闡明。周斌團隊長期致力于小鼠體內(nèi)譜系示蹤新技術的開發(fā)和應用，曾利用雙重組酶介導的譜系示蹤技術解決了多個領域內(nèi)重大科學問題，有力地推動了相關研究領域的發(fā)展和進步。
為了闡明AT2細胞的再生來源，研究人員首先對傳統(tǒng)的單同源重組酶驅(qū)動的譜系示蹤工具進行了系統(tǒng)性鑒定。Hopx-CreER是肺干細胞領域內(nèi)普遍使用的AT1細胞標記示蹤工具，對成體Hopx-CreER；R26-tdT工具小鼠進行肺切除手術（Pneumonectomy，PNX）或博來霉素（Bleomycin）誘導肺損傷后，發(fā)現(xiàn)標記的Hopx+細胞確實可以轉(zhuǎn)分化為AT2細胞。然而對穩(wěn)態(tài)下Hopx-CreER；R26-tdT工具小鼠的肺臟切片進行免疫熒光染色及統(tǒng)計分析后，發(fā)現(xiàn)此遺傳工具除了高效率標記AT1細胞外，還“異位”或者“非特異”標記~66% club細胞、~12% BASCs、~92% ciliated細胞，還有極少量AT2細胞（~0.24%）。由于BASCs、club細胞和AT2細胞本身已被報道可以作為干細胞在肺損后貢獻AT2細胞，因此會對Hopx-CreER；R26-tdT的譜系示蹤結果產(chǎn)生很大干擾。為了探究Hopx-CreER的非特異性標記是否由于Hopx一條等位基因敲除引起的，研究人員構建了Hopx-2A-DreER。通過對Hopx-2A-DreER；R26-RSR-tdT工具小鼠肺臟進行檢測，同樣的發(fā)現(xiàn)tdTomato除了標記AT1細胞外，還“非特異”標記ciliated細胞、club細胞和少部分BASCs。研究人員進一步對另一種領域內(nèi)使用的AT1遺傳工具Ager-CreER進行鑒定，發(fā)現(xiàn)該工具除了高效率標記AT1細胞外還會“異位”標記一部分AT2細胞和少量BASCs。通過以上實驗，研究人員揭示基于Hopx基因或Ager基因的傳統(tǒng)單同源重組酶驅(qū)動的譜系示蹤技術具有非特異性標記問題，因此無法利用其對AT1細胞進行嚴格的譜系示蹤研究。
得到以上結果后，研究人員意識到領域內(nèi)迫切需要構建譜系示蹤新技術來實現(xiàn)對AT1細胞的特異性標記，于是提出利用雙同源重組酶驅(qū)動的譜系示蹤新技術來解決此難題。通過對比，研究人員發(fā)現(xiàn)Hopx-2A-DreER與Ager-CreER非特異性標記的細胞類型具有“互斥”特點，即Hopx-2A-DreER除了標記AT1細胞外會“異位”標記ciliated細胞、club細胞和少量BASCs，而Ager-CreER除了標記AT1細胞外會“異位”標記AT2細胞和少量BASCs?；谶@個“互斥”特點，研究人員首先通過交叉標記策略（Intersectional strategy）構建了雙同源重組遺傳工具：Hopx-2A-DreER；Ager-CreER；R26-RSR-LSL-tdT，只有同時發(fā)生Dre-rox和Cre-loxP重組的細胞中，報告基因tdTomato才會表達，進而實現(xiàn)對Hopx+Ager+ AT1細胞特異性標記。結合多種肺損傷模型（肺切、博來霉素和高氧損傷），研究人員發(fā)現(xiàn)在肺損后AT1細胞不會轉(zhuǎn)分化為AT2細胞，AT1細胞屬于終末分化細胞。研究人員進一步通過嵌套策略（Nested strategy）構建了另一種雙同源重組遺傳工具：Hopx-2A-DreER；Sox2-CreER；Sftpc-CreER;R26-NR2。在此策略中，Hopx+AT1細胞會被特異性標記為ZsGreen，而“非特異”標記的club細胞、ciliated細胞、BASCs及AT2細胞均會被統(tǒng)一標記為tdTomato。然而結合多種肺損傷模型，研究人員仍然未檢測到標記的AT1細胞轉(zhuǎn)分化為AT2細胞。通過以上兩種雙同源重組譜系示蹤新技術，研究人員揭示在肺損后AT1細胞不具備可塑性，不會轉(zhuǎn)分化為AT2細胞。
研究人員進一步指出領域內(nèi)club細胞遺傳工具Scgb1a1-CreER同樣具有非特異性標記問題，Scgb1a1-CreER；R26-tdT除了標記club細胞外還會“異位”標記BASCs和少量AT2細胞，這會對club細胞的譜系示蹤結果產(chǎn)生干擾。因此研究人員基于Cre-loxP和Dre-rox構建了另一種雙同源重組譜系示蹤新策略，即Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-TLR遺傳工具，解決以上非特異性標記問題。在此系統(tǒng)中club細胞內(nèi)會發(fā)生Cre-loxP重組被標記為tdTomato；AT2細胞內(nèi)會發(fā)生Dre-rox重組被標記為ZsGreen；BASCs內(nèi)同時發(fā)生Cre-loxP和Dre-rox重組會被標記為tdTomato和ZsGreen，從而展現(xiàn)出黃色熒光標記。因此，該新技術可以實現(xiàn)對club細胞、BASCs和AT2細胞這三種細胞群同時特異性遺傳標記，分別稱之為Club-tracer、AT2-tracer和BASC-tracer。結合博來霉素損傷模型，研究人員發(fā)現(xiàn)肺損后club細胞和BASCs會大量分化為肺泡上皮（包括AT2和AT1細胞）進而促進肺泡再生，對肺泡損傷區(qū)域進行統(tǒng)計，顯示~27%和~11%新生AT2細胞分別起源于club細胞和BASCs。為進一步挖掘club細胞對肺泡上皮修復的潛力，研究人員計劃通過誘導BASCs和AT2細胞過表達p21蛋白封閉細胞增殖能力，使之不能參與再生修復，以此激發(fā)club細胞的可塑性潛力。為了實現(xiàn)這一目的，研究人員設計了一種新的雙同源重組系統(tǒng)，即Sftpc-DreER；R26-rox-p21-GFP；Scgb1a1-CreER；R26-LZL-tdT遺傳工具，club細胞內(nèi)發(fā)生Cre-loxP重組被標記為tdTomato；AT2細胞內(nèi)會發(fā)生Dre-rox重組被標記為GFP并表達p21蛋白；BASCs內(nèi)同時發(fā)生Cre-loxP和Dre-rox重組會被標記為tdTomato和GFP并表達p21蛋白。對此系統(tǒng)成功驗證后，研究人員隨即結合博來霉素損傷模型來探究club細胞的可塑性。收取損傷4周后的肺臟進行分析，發(fā)現(xiàn)AT2細胞和BASCs原本的修復能力成功被抑制，并發(fā)現(xiàn)club細胞大量轉(zhuǎn)分化為新生AT2細胞和AT1細胞，統(tǒng)計顯示損傷區(qū)域~47%AT2細胞起源于club細胞。研究人員進一步分析了長時程（損傷后8個月）修復的肺臟，驚奇的發(fā)現(xiàn)與4周相比，club細胞貢獻的E-cad+肺泡上皮（包括AT2細胞和AT1細胞）比例顯著性上升，統(tǒng)計顯示~82% AT2細胞起源于club細胞。在損傷嚴重的肺葉中，club起源的肺泡上皮細胞可以覆蓋絕大部分肺泡區(qū)域。以上結果說明肺損后當AT2細胞和BASCs修復能力被抑制時，club細胞會被委以重任，成為肺泡干細胞再生的主要來源。
那么是何種信號通路調(diào)控club細胞及BASCs向AT2細胞發(fā)生細胞命運轉(zhuǎn)變？這兩種不同干細胞產(chǎn)生AT2細胞的分子調(diào)控機制是否一樣？為了探明這一點，研究人員首先從損傷4周的Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-TLR工具小鼠中分選了Club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer標記細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析（scRNA-seq）。UMAP分析顯示Club-tracer標記的細胞可以被劃分為7個細胞亞群（cell cluster），這些細胞亞群具有不同的基因表達特點，可依次劃為AT2細胞群、Club細胞群、Basal-like細胞群、Cldn18highPreAT1細胞群、Fstl1+transient細胞群、transient細胞群和H2-K1+club細胞群。擬時序分析揭示這些細胞亞群之間具有緊密的譜系聯(lián)系，club細胞和H2-K1+club細胞作為起點可轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>Basal-like和Fstl1+ transient細胞，也可以通過transient細胞分化為AT2細胞和Cldn18highPreAT1細胞。另一方面，UMAP分析顯示根據(jù)基因表達BASC-tracer標記的細胞也可被劃分為7個細胞亞群，包括Cldn4highPreAT1細胞群、Cxcl15highAT2細胞群、BASC-like 細胞群、Chil1highAT2細胞群、EreghighAT2細胞群、transient細胞群和AT1細胞群。這些細胞亞群在基因表達譜系上具有連貫性，擬時序分析顯示細胞分化譜系起始于BASC-like細胞，然后經(jīng)過transient細胞可依次分化為Cxcl15highAT2、EreghighAT2、Cldn4highPreAT1及AT1細胞，或經(jīng)Cxcl15highAT2可分化為Chil1highAT2細胞。通過對Club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer中的AT2細胞進行對比分析，發(fā)現(xiàn)BASC-tracer中的AT2細胞在基因表達上更接近于AT2-tracer中的AT2細胞。
通過進一步分析，研究人員發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在club細胞向AT2細胞轉(zhuǎn)分化及BASCs向AT2轉(zhuǎn)分化過程中具有下調(diào)趨勢，暗示Notch信號通路可能在細胞命運轉(zhuǎn)變中發(fā)揮調(diào)控作用。為進一步體內(nèi)驗證，研究人員結合雙同源重組譜系示蹤技術與條件性基因敲除技術構建了Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-TLR；Rbpjflox/flox工具小鼠（實驗組）和Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-TLR；Rbpjflox/+工具小鼠（對照組），可實現(xiàn)在體內(nèi)示蹤Club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer的同時實現(xiàn)在club細胞和BASCs中特異性敲除Notch信號通路。結合博來霉素損傷模型，研究人員發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲除組中club細胞貢獻的AT2細胞比例顯著性降低，而BASCs貢獻的AT2細胞比例顯著性上升。此實驗證實Notch通路在club及BASCs向AT2轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)揮重要作用，并且屬于兩種截然相反的調(diào)控作用。為進一步研究Notch通路激活是否會影響BASCs向AT2細胞轉(zhuǎn)分化，研究人員利用雙同源重組譜系示蹤技術構建了Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-RL-NICD-GFP遺傳工具，可實現(xiàn)對BASCs特異性標記并過表達NICD。結合博來霉素損傷模型，研究人員發(fā)現(xiàn)與對照組（Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-RL-GFP）相比，過表達Notch會顯著抑制BASCs向AT2細胞轉(zhuǎn)分化。以上實驗證明club細胞可作為AT2細胞的再生起源，并且首次在功能層面上揭示club細胞與BASCs屬于兩種不同細胞類型，不僅具有不同基因表達特點，而且在向AT2細胞分化過程中受Notch通路相反的調(diào)控。
綜上，該研究通過構建精準的雙同源重組譜系示蹤技術系統(tǒng)嚴格地解析了肺損傷后肺泡上皮干細胞的再生起源，并揭示其分子調(diào)控機制，為肺臟干細胞和修復再生領域提供新技術和新方法，也為肺臟疾病的臨床治療研究提供新的治療靶點和重要研究基礎。
國科大杭州高等研究院/中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心周斌研究組副研究員劉擴、上?？萍即髮W博士生孟鑫鳳和中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心博士生劉子鑫為該論文共同第一作者。周斌研究員為該論文通訊作者。該研究得到分子細胞卓越中心動物實驗技術平臺和細胞分析技術平臺及中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所細胞分析技術平臺的大力支持。該工作得到中國科學院、國家自然科學基金委、科技部、上海市科委、國科大杭州高等研究院、新基石科學基金會等支持。
文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.010
圖注：肺臟損傷后AT2細胞的再生起源
利用雙同源重組酶介導的遺傳譜系示蹤技術特異性標記各種不同肺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)新生AT2細胞除了來源于自我更新外還會起源于club細胞與BASCs，而非AT1細胞。Notch信號通路在club細胞和BASCs向AT2細胞發(fā)生命運轉(zhuǎn)變中發(fā)揮截然相反的作用，即敲除Notch抑制club細胞向AT2細胞命運轉(zhuǎn)變，但促進BASCs向AT2細胞命運轉(zhuǎn)變。
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