9月8日，國際學(xué)術(shù)期刊Nature Communications在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)李典范研究組與復(fù)旦大學(xué)的屈前輝課題組的合作研究成果“Structures of Liganded Glycosylphosphatidylinositol Transamidase Illuminate GPI-AP Biogenesis”，揭示了糖基磷脂酰肌醇(GPI)轉(zhuǎn)酰胺酶(GPI-T)復(fù)合物識(shí)別廣泛底物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和防止意外剪切的自抑制機(jī)制。該項(xiàng)工作入選“50篇展示論文”( https://www.nature.com/collections/hhfigaahch)。
GPI修飾是真核生物中普遍存在的翻譯后修飾。水溶性前體蛋白通過GPI修飾而錨定在細(xì)胞膜上，行使包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、催化、細(xì)胞黏附等在內(nèi)的基本生物學(xué)功能。GPI-T是GPI錨定蛋白(GPI-AP)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，它是一個(gè)五元跨膜復(fù)合物，負(fù)責(zé)將前體蛋白C端的信號(hào)肽切除并將脂分子GPI連接到新暴露的C末端。與大多數(shù)蛋白水解酶不同，GPI-T識(shí)別的肽段序列不具有序列唯一性，而僅有模糊的親疏水排列特征。其切割位點(diǎn)(w位點(diǎn))通常為側(cè)鏈較小的氨基酸，切割位點(diǎn)至C末端疏水段由~10個(gè)親水氨基酸殘基的肽段相連(圖1a)。如何實(shí)現(xiàn)底物寬泛性與催化保真性這一“矛盾統(tǒng)一體”，是GPI-AP生物合成中一個(gè)重要的生化機(jī)制問題。
研究組前期解析了人源GPI-T的2.53埃冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)，揭示了其異源五聚體的組裝機(jī)制(圖1b)，這項(xiàng)工作于2022年5月發(fā)表在《Nature Communications》期刊。但GPI-T同時(shí)實(shí)現(xiàn)底物寬泛性(圖1a)與催化保真性的機(jī)制仍不明確。
要回答上述問題需要解析GPI-T與底物(前體蛋白、GPI)或者與產(chǎn)物(GPI-AP、信號(hào)肽)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。因?yàn)镚PI分子目前尚不能通過化學(xué)方法合成，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了細(xì)胞工程與蛋白質(zhì)工程方法。通過基因敲除與點(diǎn)突變相結(jié)合的手段，成功地將GPI-T復(fù)合體分別停留在“底物結(jié)合”和“產(chǎn)物結(jié)合”狀態(tài)，并解析了二者的高分辨率結(jié)構(gòu)(圖2a，2b)。結(jié)合活性分析體系，揭示了GPI-T同時(shí)實(shí)現(xiàn)底物寬泛性與催化保真性這一“矛盾統(tǒng)一體”的機(jī)制。
在保真性上，GPI-T使用一個(gè)自抑制環(huán)鎖定于非活性構(gòu)象(圖2c)。而且激活過程的構(gòu)象變化需要打破數(shù)個(gè)氫鍵、鹽鍵相互作用并引入電荷及親疏水排斥。這種多重保護(hù)機(jī)制避免了因底物寬泛性而造成的意外水解。
底物結(jié)合GPI-T時(shí)，信號(hào)肽與復(fù)合體的結(jié)合提供結(jié)合能，促使GPI-T亞基以剛性移動(dòng)為主的構(gòu)象變化，啟動(dòng)上述耗能的激活過程，打開自抑制環(huán)，同時(shí)，信號(hào)肽近催化部位的親水部分通過誘導(dǎo)契合的方式，促使GPI-T催化中心的精確重構(gòu)(圖2d)。
研究團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)了“功能增強(qiáng)突變體”以及“功能喪失突變體”，證明了所提出的自抑制與底物結(jié)合誘導(dǎo)的激活機(jī)制。
此外，該工作還揭示了GPI-T識(shí)別寬泛性底物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和催化的生化機(jī)制。
分子細(xì)胞卓越中心李典范研究員和復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院青年研究員屈前輝為該論文的共同通訊作者。分子細(xì)胞卓越中心研究生徐乙丹為該論文第一作者。分子細(xì)胞卓越中心博士后李婷婷、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院/附屬口腔醫(yī)院博士后周子璇、博士生洪晶晶和晁鈺琳、朱之妮、張穎教授等都做了重要貢獻(xiàn)。該研究得到國家自然基金委及中國科學(xué)院的資助。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41281-y
圖1. GPI-T的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及其活性中心組成。a GPI-T催化反應(yīng)及底物特征示意圖。b GPI-T的冷凍電鏡密度圖。
圖2. GPI-T與底物、產(chǎn)物結(jié)合的結(jié)構(gòu)揭示自抑制與激活機(jī)制。a, b GPI-T與底物 (a)、產(chǎn)物 (b) 的冷凍電鏡密度圖。c 自抑制環(huán)（紅色）占據(jù)了底物（綠色）結(jié)合口袋。d GPI-T從自抑制狀態(tài)（藍(lán)色）向活性構(gòu)象（洋紅色）的構(gòu)象變化。e GPI-T的激活過程。
