6月12日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)在線發(fā)表了國(guó)科大杭州高等研究院生命與健康學(xué)院/中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組與復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陸路課題組合作研究成果“An inducible hACE2 transgenic mouse model recapitulates SARS-CoV-2 infection and pathogenesis in vivo”。該研究利用Cre-loxP遺傳譜系示蹤技術(shù)與人源化hACE2結(jié)合，創(chuàng)建了一種誘導(dǎo)型hACE2小鼠模型，結(jié)合細(xì)胞特異性Cre工具小鼠可實(shí)現(xiàn)在靶細(xì)胞中特異性表達(dá)hACE2蛋白并同時(shí)對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行遺傳示蹤。此誘導(dǎo)型hACE2小鼠模型不僅適用于對(duì)SARS-CoV-2藥物篩選和疫苗評(píng)價(jià)，還可應(yīng)用于SARS-CoV-2感染相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制和遺傳學(xué)研究。

　　新型冠狀病毒感染(COVID-19)是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道傳染病。盡管目前全世界已經(jīng)步入后疫情時(shí)代，但疫情并未完全消失，依然會(huì)出現(xiàn)小規(guī)模傳播或波浪式流行態(tài)勢(shì)，其重癥患者易出現(xiàn)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，威脅患者生命健康。病毒變異具有隨機(jī)性，因此構(gòu)建適用于SARS-CoV-2等可利用ACE2受體感染的各類冠狀病毒(包括SARS-CoV及SARS相關(guān)冠狀病毒、HCoV-NL63等)研究的小鼠模型對(duì)于研究SARS-CoV-2等致病機(jī)理并測(cè)試新型治療方案，應(yīng)對(duì)將來未知風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

　　SARS-CoV-2可通過識(shí)別人體細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(hACE2)進(jìn)入人體細(xì)胞。人體中多種組織臟器表達(dá)hACE2，例如上呼吸道、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、腸道和大腦等等，因此這些器官都會(huì)被SARS-CoV-2識(shí)別并攻擊。肺部是SARS-CoV-2攻擊的首要目標(biāo)。人類肺臟中多種上皮細(xì)胞類型表達(dá)hACE2，包括I型肺泡上皮細(xì)胞(AT1細(xì)胞)、II肺泡上皮細(xì)胞(AT2細(xì)胞)、分泌細(xì)胞(club細(xì)胞)、基底細(xì)胞(basal細(xì)胞)和纖毛細(xì)胞(ciliated細(xì)胞)等。其中AT2細(xì)胞負(fù)責(zé)肺泡上皮受損后的再生修復(fù)，人體AT2細(xì)胞高表達(dá)hACE2，是SARS-CoV-2在肺部的重要攻擊對(duì)象之一。

　　人源化小鼠是研究人類疾病的重要模型，研究發(fā)現(xiàn)小鼠細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(mACE2)不易于被SARS-CoV-2識(shí)別，因此構(gòu)建的人源化hACE2新冠小鼠感染模型被廣泛應(yīng)用于新冠病毒感染相關(guān)研究。目前已報(bào)道多種人源化hACE2轉(zhuǎn)基因模型小鼠，這些hACE2的表達(dá)受Krt8，HFH4，CAG或mACE2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。然而Krt8在肺臟主要表達(dá)在支氣管管腔上皮細(xì)胞，HFH4主要表達(dá)在支氣管ciliated細(xì)胞，CAG為廣譜型啟動(dòng)子在所有細(xì)胞類型表達(dá)。在本研究中，研究人員構(gòu)建了mACE2-2A-CreER;R26-tdTomato工具小鼠并揭示在小鼠肺臟中mACE2主要表達(dá)在支氣管club細(xì)胞中。因此，基于上述啟動(dòng)子構(gòu)建的hACE2轉(zhuǎn)基因工具均無法完全模擬人體內(nèi)hACE2的表達(dá)譜，特別是對(duì)AT2細(xì)胞的靶向。為了解決這一問題，研究人員將CAG-loxp-stop-loxp-hACE2-IRES-tdTomato序列插入到Rosa26基因位點(diǎn)，構(gòu)建了一種可誘導(dǎo)型hACE2轉(zhuǎn)基因模型小鼠，簡(jiǎn)稱為R26-hACE2-tdT。R26-hACE2-tdT的工作原理為，當(dāng)發(fā)生Cre-loxP重組，Cre⁺細(xì)胞會(huì)同時(shí)表達(dá)hACE2和tdTomato蛋白，由于這種同源重組發(fā)生在DNA水平，所以Cre⁺細(xì)胞及其所有子代細(xì)胞均會(huì)永久性表達(dá)hACE2并被標(biāo)記為tdTomato。針對(duì)以上提到的已有hACE2工具細(xì)胞靶向的不足，R26-hACE2-tdT可以結(jié)合細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的工具小鼠，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性及高效性靶向標(biāo)記，以精確模擬和應(yīng)用于SARS-CoV-2攻擊人體細(xì)胞的病理研究。

　　為了驗(yàn)證R26-hACE2-tdT小鼠模型，研究人員以AT2細(xì)胞，club細(xì)胞和ciliated細(xì)胞為例，分別構(gòu)建了AT2-hACE2、Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型小鼠進(jìn)行SARS-CoV-2感染驗(yàn)證。因?yàn)锳T2細(xì)胞是已有hACE2模型小鼠首要遺漏標(biāo)記靶細(xì)胞，所以研究人員首先結(jié)合AT2細(xì)胞特異性工具小鼠Sftpc-CreER構(gòu)建了AT2細(xì)胞特異性表達(dá)hACE2小鼠模型：AT2-hACE2(Sftpc-CreER;R26-hACE2-tdT)。對(duì)AT2-hACE2小鼠模型進(jìn)行SARS-CoV-2感染后第4、7、14天(dpi)收樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肺部AT2細(xì)胞可被SARS-CoV-2特異性靶向，病理切片染色顯示4 dpi肺部出現(xiàn)多種病理表型，并與新冠患者病理特征類似，包括肺泡壁增厚、纖維化沉積、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及血細(xì)胞滲漏等。這些病理特征在14 dpi得到明顯緩解，并且小鼠肺部病毒載量隨著時(shí)間推移呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明SARS-CoV-2感染后致病進(jìn)程會(huì)有一個(gè)從嚴(yán)重到緩解的過程，這也與多數(shù)新冠患者的病情進(jìn)展一致，隨著時(shí)間推移肺炎會(huì)緩慢自愈。

　　為了驗(yàn)證新冠病毒感染工具小鼠對(duì)靶細(xì)胞的可選擇性，研究人員又結(jié)合club細(xì)胞特異性工具小鼠Scgb1a1-CreER及ciliated細(xì)胞特異性工具小鼠Foxj1-CreER分別構(gòu)建了Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型，進(jìn)行SARS-CoV-2感染后第4、7、14天(dpi)收樣檢測(cè)。同樣的，研究人員檢測(cè)到了與新冠患者肺部相似的病理特征，包括肺部纖維化、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及血細(xì)胞滲漏等。隨著時(shí)間推移，肺部病理特征也具有從嚴(yán)重到緩解的過程。與AT2-hACE2模型不同的是，Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型感染后病理?yè)p傷會(huì)在支氣管周圍有積聚趨勢(shì)，說明不同細(xì)胞類型感染后或不同區(qū)域感染后引起的病理表型具有差異性。然而新冠病毒感染者肺部炎癥發(fā)展是多種細(xì)胞被感染后的綜合性表現(xiàn)，其中每種類型細(xì)胞對(duì)感染的響應(yīng)是否具有差異，是否可以針對(duì)這種差異開展細(xì)胞靶向治療是未來需要探究的問題之一。綜上，本研究基于Cre-loxP技術(shù)成功構(gòu)建了可誘導(dǎo)型人源化hACE2小鼠模型，可搭配細(xì)胞特異性Cre遺傳工具，不僅適用于對(duì)靶細(xì)胞特異性SARS-CoV-2感染研究、藥物篩選、疫苗評(píng)價(jià)，還可應(yīng)用于感染后組織再生修復(fù)的遺傳學(xué)等研究。

　　國(guó)科大杭州高等研究院周斌課題組副研究員劉擴(kuò)、中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士研究生唐慕雪、復(fù)旦大學(xué)青年副研究員徐巍為該論文共同第一作者。杭州高等研究院生命與健康學(xué)院/中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究員和復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陸路研究員為該論文共同通訊作者。該工作得到中國(guó)科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委、杭高院等經(jīng)費(fèi)支持。

　　文章鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2207210120

圖注：誘導(dǎo)型hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建及應(yīng)用策略

(A)R26-hACE2-tdT構(gòu)建策略。(B，C)結(jié)合細(xì)胞特異性Cre工具，可實(shí)現(xiàn)在靶細(xì)胞中特異性表達(dá)hACE2并被永久性遺傳標(biāo)記。