北京時間4月24日，國際學術期刊Cell以Research Article的形式在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心(生物化學與細胞生物學研究所)孟飛龍研究組的最新成果“Mesoscale DNA Feature in Antibody-Coding Sequence Facilitates Somatic Hypermutation”。該研究基于經典生化方法與高通量測序技術，建立了體外檢測抗體基因超突變的一系列新方法，從而揭示了抗體基因互補決定區(qū)(CDR)通過高度柔性特征引發(fā)超高突變的分子機理。胞苷脫氨酶AID在B淋巴細胞中啟動了抗體基因超突變，其蛋白表面具有大片正電荷片區(qū);而抗體基因CDR編碼區(qū)域DNA序列則在進化中獲得了高度柔性的特征。酶與底物的協(xié)同進化共同促進了CDR區(qū)的超突變偏好。該工作為下一代抗體基因人源化動物模型的設計提供了底層理論。
抗體作為適應性免疫系統(tǒng)中的關鍵效應分子，時刻守衛(wèi)著機體的健康。面對復雜多變的外界環(huán)境，機體的免疫系統(tǒng)通過抗體多樣化機制產生數量龐大的抗體分子，從而特異性地識別和清除病原體?？贵w多樣化通常包含兩個主要步驟，(1)核酸內切酶RAG介導的的V(D)J重排過程;(2)胞苷脫氨酶AID起始的體細胞超突變(SHM)和抗體類型轉換(CSR)過程。體細胞超突變可在抗體基因的可變區(qū)編碼區(qū)引入高頻突變。但是，超突變在抗體可變區(qū)外顯子上并非均勻分布，而偏好性積累在可變區(qū)中的互補決定區(qū)(CDR)。超突變?yōu)槭裁淳哂衅眯裕谏鲜兰o八十年代由著名免疫學家David Baltimore與Klaus Rajewsky提出。近40多年來，這一領域嘗試從多個角度去解釋這一現(xiàn)象，但一直都沒有令人非常信服的結論。CDR偏好突變科學問題的解決亟需引入新的概念。胞苷脫氨酶AID是一個僅含198個氨基酸的蛋白質。生化實驗證明AID作用于單鏈DNA底物，并且偏好作用于WRC(W=A/T, R=A/G)基序。但是WRC基序并不能解釋抗體基因CDR偏好超突變，因為同樣的WRC基序在CDR編碼區(qū)突變率超高。在CDR編碼區(qū)的中尺度(5-50bp)中，AID可能受到局部序列的調控。
孟飛龍研究組長期致力于免疫受體多樣化機制研究。在最新的這項研究中，他們從經典的生化方法出發(fā)聯(lián)合高通量測序技術，首先建立了體外檢測抗體基因突變的新體系，發(fā)現(xiàn)AID酶活反應重現(xiàn)了小鼠體內抗體基因突變譜式。隨后，他們將生化實驗的DNA底物擴展到27種有頜脊椎動物的1000余條抗體基因序列，發(fā)現(xiàn)CDR突變偏好在使用體細胞高頻突變(SHM)作為抗體主要多樣化策略的四足動物(包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鴨嘴獸以及羊駝等)中高度保守。那么這種突變偏好是否受DNA序列上下文的影響呢?
為了回答這個問題，研究人員在小鼠體內將一段抗體基因的DNA序列進行隨機置換，發(fā)現(xiàn)序列改變后突變頻率發(fā)生了顯著變化。這一結果提示不同的DNA序列上下文中可能含有未知的中尺度順式因子，從而調控突變頻率的作用。因此，研究人員通過基因編輯在CDR3區(qū)引入隨機序列改變，快速獲得了十幾種攜帶不同CDR3序列環(huán)境的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)序列改變越靠近CDR3區(qū)內的突變熱點對該位點的突變頻率影響越大。因此，研究人員繼續(xù)將序列上下文范圍縮小到突變位點上下游各12-15 nt。
通過分子動力學模擬和多種單分子生化實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)中尺度中DNA序列柔性越大越有利于結合AID表面的正電荷片區(qū)，進而越有助于突變的發(fā)生。單鏈DNA的柔韌性與嘧啶-嘧啶二核苷酸的含量呈正相關。此外，通過分析抗體基因序列特征以及突變譜式，研究人員發(fā)現(xiàn)抗體基因CDR的編碼序列在進化中獲得了高度柔性的特征。最后，研究人員分別在B細胞系和小鼠體內將一段柔性序列插入突變低頻區(qū)FR，發(fā)現(xiàn)柔性序列極大地提高了FR的突變頻率。
綜上，該研究解答了長期困擾這一領域的難題，發(fā)現(xiàn)抗體基因CDR編碼區(qū)DNA柔性促進了偏好性突變的發(fā)生，抗體基因編碼序列具有調控AID突變靶向的非編碼功能。這一工作為DNA力學性質參與調控細胞生命過程中提供了例證，也提示DNA柔性等力學性質可能在其他生命活動如腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。中尺度序列特征的發(fā)現(xiàn)，為設計下一代抗體基因人源化動物模型構筑了底層理論。
分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心博士生王燕燕為該論文的第一作者，中心孟飛龍研究員和上海交通大學醫(yī)學院葉菱秀研究員為該論文的共同通訊作者。上海師范大學數學系博士生張森欣在數據分析，上海交通大學博士生楊欣瑞在分子動力學模擬，哈佛大學Joyce Hwang和王寵在模型構建等方面作出重要貢獻。該工作得到上海交通大學達林泰教授、上海交通大學醫(yī)學院鄭小琪教授、哈佛大學醫(yī)學院Frederick W. Alt教授、中國農業(yè)大學趙要風教授、瑞典卡羅林斯卡研究所Qiang Pan-Hammarstrom教授、中國科學院杭州醫(yī)學所宋杰研究員、中國科學院生物物理研究所黃韶輝研究員、復旦大學曹志偉教授、分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心劉珈泉研究員等合作實驗室老師和同學的大力支持。該工作得到分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心動物實驗技術平臺、細胞分析技術平臺、分子生物學技術平臺的支持，同時得到來自基金委、科技部、中國科學院、上海市科委等部門的經費支持。
文章鏈接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00327-6
DNA柔性在抗體基因超突變中的生理功能
