3月23日，國際學(xué)術(shù)期刊Nature Genetics在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所）周斌研究組發(fā)表的研究論文“Dual genetic tracing reveals a unique fibroblast subpopulation modulating cardiac fibrosis”。

　　周斌研究組科研人員開發(fā)了雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤系統(tǒng)來特異性追蹤心內(nèi)膜起源的成纖維細胞（Endocardium-derived fibroblast, EndoFb），揭示了EndoFb是調(diào)節(jié)心臟纖維化的獨特成纖維細胞亞群。利用EndoFb-tracer系統(tǒng)，研究人員發(fā)現(xiàn)在心臟發(fā)育和成體穩(wěn)態(tài)情況下EndoFb具有非常明顯的區(qū)域性分布特征，在心臟壓力負荷下（TAC模型），EndoFb比其他成纖維細胞亞群更具增殖潛能。通過Fb-ProTracer系統(tǒng)，研究人員實現(xiàn)了不依賴于預(yù)先標(biāo)記成纖維細胞亞群、無偏好地評估成纖維細胞在穩(wěn)態(tài)或損傷后的增殖情況，揭示了TAC后成纖維細胞的增殖區(qū)域性。利用EndoFb-DTR系統(tǒng)，研究人員在遺傳學(xué)水平上特異性清除EndoFb，發(fā)現(xiàn)EndoFb清除后可顯著緩解TAC引起的心臟纖維化并減緩了心臟衰竭的進程，證實了EndoFb調(diào)控心臟纖維化和病理性心肌重塑。通過構(gòu)建成纖維細胞亞群特異性基因敲除Ctnnb1-KO系統(tǒng)，揭示W(wǎng)nt信號通路是TAC后調(diào)控EndoFb擴張的重要分子機制。

　　心力衰竭每年都會導(dǎo)致全球范圍內(nèi)大量的個體致病或死亡。相較于其他組織器官，哺乳動物心臟是成體動物所有組織器官中再生能力最差的器官，這主要歸因于心肌細胞薄弱的增殖潛能。事實上，心肌細胞只占成體哺乳動物心臟中所有細胞的大約30%，心臟中的非心肌細胞，包括內(nèi)皮細胞，成纖維細胞，周細胞，平滑肌細胞以及造血細胞等是心臟中其他主要的細胞類型。其中，心臟成纖維細胞對于維持心臟的基本結(jié)構(gòu)與功能，以及在病理條件下調(diào)節(jié)心臟重塑起著關(guān)鍵作用。在心臟損傷早期，心臟成纖維細胞被激活并分化成具有收縮性的肌成纖維細胞，產(chǎn)生大量的胞外基質(zhì)，生成富含膠原的疤痕，修補由于心肌死亡導(dǎo)致的心臟缺損，維持心臟基本功能。然而，成纖維細胞增殖過多會導(dǎo)致胞外基質(zhì)的過度積累并導(dǎo)致心臟彈性減弱，降低心室壁的順應(yīng)性，從而嚴(yán)重影響心臟功能，最終促使心力衰竭。因此，了解驅(qū)動心臟纖維化病理過程的基本機制，對于把控成纖維細胞在心臟損傷后的適度增殖，更大程度地發(fā)揮成纖維細胞保護心臟功能的作用至關(guān)重要，并為開發(fā)治療心臟纖維化的潛在靶標(biāo)提供新的思路和見解，對緩解心臟衰竭、提高患者生存質(zhì)量具有臨床指導(dǎo)意義。

　　之前的研究主要用單同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤方法，通過心內(nèi)膜的遺傳工具小鼠和心外膜的遺傳工具小鼠去研究心內(nèi)膜衍生的成纖維細胞和心外膜衍生的成纖維細胞。然而，傳統(tǒng)的遺傳譜系示蹤方法雖然能夠示蹤到不同的成纖維細胞亞群，但是由于心內(nèi)膜細胞和心外膜細胞還會貢獻給許多其他細胞類型，包括血管內(nèi)皮細胞、周細胞、平滑肌細胞、脂肪細胞等，這些細胞類型的存在不僅會干擾研究人員對成纖維細胞在穩(wěn)態(tài)和損傷情況下的表型探究，也無法僅對成纖維細胞進行特異性的遺傳操作，這就使得探究不同成纖維細胞亞群對心臟纖維化和心力衰竭影響的潛在機制成為一個難題。

　　本研究中，研究人員首先構(gòu)建了高效穩(wěn)定的特異性追蹤心內(nèi)膜來源的成纖維細胞亞群的遺傳學(xué)模型，為探究EndoFb在心臟纖維化過程中的細胞及分子機制研究奠定基礎(chǔ)。研究人員將心內(nèi)膜的工具小鼠Nfatc1-Dre，成纖維細胞的工具小鼠Col1a2-CreER，與雙系統(tǒng)報告基因小鼠R26-RL-GFP交配，產(chǎn)生Nfatc1-Dre;Col1a2-CreER;R26-RL-GFP（EndoFb-tracer）小鼠。在該系統(tǒng)中，Dre-rox重組去除第一個Stop，隨后的Cre-loxP重組在他莫西芬（Tam）誘導(dǎo)下去除第二個Stop，實現(xiàn)了用GFP報告基因永久遺傳標(biāo)記EndoFb。在發(fā)育的心臟中對EndoFb-tracer小鼠進行Tam注射，研究人員發(fā)現(xiàn)GFP⁺的EndoFb主要分布在室間隔的上半部分和左心室的小梁心肌層，較少分布于右心室以及左心室的致密心肌層。為了在成體損傷情況下高效標(biāo)記EndoFb和其他成纖維細胞亞群，研究人員在EndoFb-tracer系統(tǒng)中引入R26-LSL-tdTomato報告基因小鼠，在Nfatc1-Dre;Col1a2-CreER;R26-RL-GFP;R26-LSL-tdTomato四基因小鼠中，EndoFb被標(biāo)記成GFP⁺tdTomato⁺，其他來源的成纖維細胞（主要是EpiFb）被標(biāo)記為GFP^–tdTomato⁺。通過流式細胞術(shù)和EdU摻入實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)，TAC損傷后EndoFb的擴增潛能明顯高于其他來源的成纖維細胞，且在纖維化區(qū)域高度富集。

　　為了在心臟損傷后無偏好地評估成纖維細胞的增殖情況，研究人員在最近報道的體內(nèi)細胞增殖示蹤技術(shù)ProTracer的基礎(chǔ)上，設(shè)計了成纖維細胞特異的Fb-ProTracer系統(tǒng)。利用Col1a2-CreER這個成纖維細胞工具小鼠，結(jié)合Ki67-LSL-2A-Dre，以及雙系統(tǒng)報告基因小鼠R26-RL-GFP，獲得Col1a2-CreER;Ki67-LSL-2A-Dre;R26-RL-GFP（Fb-ProTracer）小鼠。在該系統(tǒng)中，Tam會誘導(dǎo)Col1a2-CreER中的CreER入核以去除Ki67-LSL-2A-Dre中的Stop序列，產(chǎn)生一個新的Ki67-2A-Dre等位基因；并去除R26-RL-GFP等位基因的第一個Stop序列，注射Tam后，Ki67-2A-Dre將切除增殖的成纖維細胞中的第二個Stop序列，并開始連續(xù)記錄增殖的成纖維細胞。對TAC后的Fb-ProTracer小鼠進行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)GFP⁺的成纖維細胞主要集中在室間隔和左心室的上半部分，該表型與EndoFb在TAC損傷后的區(qū)域性擴張高度一致，進一步提示EndoFb在TAC損傷后增殖的活躍性以及EndFb在該損傷模型下對纖維化的重要貢獻。

　　為了探究TAC損傷后EndoFb對心臟纖維化的在體功能，研究人員構(gòu)建了Nfatc1-Dre;Col1a2-CreER;R26-LSL-RSR-tdT-DTR（EndoFb-DTR）小鼠，在該系統(tǒng)中，Dre-rox和Cre-loxP重組同時介導(dǎo)了tdTomato和白喉毒素受體（DTR）在EndoFb中的專一性表達。對EndoFb-DTR小鼠進行Tam注射，可將EndoFb標(biāo)記成紅色，對EndoFb-DTR小鼠進行DT處理，又可實現(xiàn)對tdTomato⁺的EndoFb遺傳性清除。在TAC后第8天對EndoFb-DTR小鼠進行DT注射以清除EndoFb，在TAC后第28天收集EndoFb-DTR小鼠心臟進行組織學(xué)分析，結(jié)果表明，與PBS處理的對照組相比，DT處理組的小鼠心臟纖維化程度減弱，心臟肥大水平下降，心肌細胞大小更接近野生型小鼠。對PBS處理組小鼠和DT處理組小鼠進行心臟功能連續(xù)監(jiān)測，統(tǒng)計結(jié)果表明，DT處理組小鼠心臟功能下降趨勢相較于PBS處理組小鼠明顯減緩。綜合以上數(shù)據(jù)，研究人員認為EndoFb對TAC后的心臟纖維化具有重要貢獻，減少EndoFb在TAC后的數(shù)量將有效保護心臟功能，減緩心臟衰竭進程。

　　鑒于EndoFb在TAC損傷后具有更強的增殖潛能，且在TAC后消除EndoFb在一定程度上減輕了心臟纖維化，為探索調(diào)控EndoFb潛在的分子機制，研究人員從EndoFb-tracer小鼠的心室中分離出GFP⁺和GFP^–的成纖維細胞進行RNA-seq分析。在假手術(shù)（Sham）組和TAC組的心臟中，跟成纖維細胞激活有關(guān)的基因，如Thbs4、Cilp、Postn、Comp、Fmod、Cthrc1和Ddah1，在GFP⁺的成纖維細胞中表達均比其在GFP^–的成纖維細胞中的表達更高。基因富集分析顯示，與GFP^–的成纖維細胞相比，GFP⁺的成纖維細胞中的Wnt信號通路和成纖維細胞增殖通路均受到正向調(diào)節(jié)。基因表達熱圖表明，與Wnt信號通路相關(guān)的基因，如Wnt10b、Ccn4、Wnt9a、Fzd4、Fzd7、Sox9、Lzts2和Dkk3，在Sham組和TAC組的GFP⁺的成纖維細胞中均被上調(diào)。綜合RNA-seq的數(shù)據(jù)，研究人員認為，TAC損傷后，EndoFb相較于心臟中其他成纖維細胞亞群處于一種更活化的狀態(tài)，且具有更活躍的增殖信號通路和Wnt信號通路基因的活化。

　　為了在EndoFb中特異性敲除Wnt信號通路，研究人員構(gòu)建了Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;Ctnnb1-flox小鼠（Ctnnb1-KO系統(tǒng)）。在這種設(shè)計中，Nfatc1-Dre中的Dre切除掉Col1a2-RSR-CreER中的rox-Stop-rox，將其變成Col1a2-CreER等位基因，CreER在Tam的作用下切除Ctnnb1-flox中的Exon1-4，從而實現(xiàn)僅在心內(nèi)膜來源的成纖維細胞中敲除Ctnnb1。為了同時追蹤EndoFb并敲除EndoFb中的Ctnnb1，研究人員將Ctnnb1-KO系統(tǒng)與R26-RL-GFP交配，獲得Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP;Ctnnb1-fl小鼠，并將其作為突變體小鼠，同時將它們的同窩小鼠Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP;Ctnnb1-wt作為對照，用于TAC后的分析。對TAC后28天的對照組小鼠心臟和突變體小鼠心臟進行組織學(xué)分析，結(jié)果表明，與對照組小鼠相比，突變體小鼠心臟中纖維化程度減輕，心臟肥大水平下降，心肌細胞大小更接近野生型小鼠。對照組小鼠和突變體小鼠進行心臟功能連續(xù)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示突變體小鼠心臟功能下降趨勢相較于對照組小鼠明顯減緩。這些數(shù)據(jù)表明，在EndoFb中特異性敲除Ctnnb1能明顯減少TAC所導(dǎo)致的心臟纖維化，并能保護心臟功能。

　　以上研究揭示了先前一直未受重視的起源于心內(nèi)膜的獨特成纖維細胞亞群（EndoFb），發(fā)現(xiàn)該亞群的成纖維細胞在心臟纖維化病理過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能，為未來心臟疾病的治療提供了一個新的潛在靶點。該研究也展示了使用雙重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤技術(shù)對于研究體內(nèi)某個細胞亞群在特定疾病發(fā)展過程中的機制和功能的優(yōu)勢，為研究亞群細胞對多種疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。

　　該項工作在分子細胞卓越中心周斌研究員的指導(dǎo)下，由博士生韓茂瑩，劉子鑫和劉磊等共同完成。感謝瑞典阿斯利康公司生物制藥研發(fā)部Qing-Dong Wang研究員，南京醫(yī)科大學(xué)心血管疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心季勇教授，美國德克薩斯州休斯頓市貝勒醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)部心臟病科Reza Ardehali教授，浙江大學(xué)附屬兒童醫(yī)院小兒心血管外科舒強教授，香港中文大學(xué)Kathy O. Lui教授，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血管外科王利新教授等對本研究的大力支持。感謝分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術(shù)平臺對本研究的大力支持。感謝中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經(jīng)費支持。

　　文章鏈接： https://www.nature.com/articles/s41588-023-01337-7 

靶向EndoFb可減緩心臟纖維化和心功能衰竭

　　注：EndoFb在心臟中呈區(qū)域性分布。在壓力負荷誘導(dǎo)的損傷后，EndoFb在纖維化區(qū)發(fā)生高度區(qū)域性增殖。EndoFb的遺傳清除或敲除EndoFb中的Wnt信號通路可明顯減少其擴張，減輕心臟纖維化的嚴(yán)重程度，并減緩心臟功能下降的進程。