3月13日，國際學術(shù)期刊Nature Genetics在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌研究組和諾華生物醫(yī)學研究所Jan S. Tchorz研究組合作發(fā)表研究論文“Bipotent transitional liver progenitor cells contribute to liver regeneration”。研究人員在人類多種肝臟疾病和小鼠肝損傷模型中鑒定出一群同時表達膽管上皮細胞和肝細胞特征的肝臟祖細胞；發(fā)現(xiàn)這群肝臟祖細胞起源于膽管上皮細胞；利用雙同源重組示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)這群肝臟祖細胞具有向膽管上皮細胞和肝細胞分化的能力；通過基因敲除及過表達發(fā)現(xiàn)Notch和WNT/β-catenin信號通路分別調(diào)控膽管上皮細胞向肝臟祖細胞、肝臟祖細胞向肝細胞的分化。

　　成體肝穩(wěn)態(tài)中，肝細胞處于靜息狀態(tài)，增殖緩慢；當肝臟發(fā)生損傷后，肝細胞重新進入細胞周期，參與損傷修復，維持肝臟功能。近年來，越來越多的實驗證明在肝臟損傷中，肝細胞具有顯著的再生能力，肝損傷主要通過肝細胞的自我增殖進行損傷修復，而肝祖細胞對肝細胞的貢獻幾乎可以忽略。然而，愛丁堡大學Forbes研究組在肝細胞中進行β1-integrin基因敲除或者p21基因過表達來抑制肝細胞的增殖，同時利用譜系示蹤技術(shù)標記膽管上皮細胞，在肝損傷模型中直接觀察到膽管上皮細胞轉(zhuǎn)分化為肝細胞，促進肝臟損傷修復。同一時期，第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院謝渭芬研究組等通過給予小鼠長期喂養(yǎng)TAA等藥物來誘導慢性肝損傷，觀察到在慢性肝損傷過程中膽管上皮細胞可以轉(zhuǎn)分化為肝細胞參與肝臟再生。隨后，多個不同研究組獨立證明在肝細胞增殖受阻的肝損傷條件下，膽管上皮細胞可以貢獻給肝細胞參與肝臟損傷修復。然而關(guān)于膽管上皮細胞向肝細胞分化是否經(jīng)歷肝臟祖細胞狀態(tài)這一細胞機制及膽管上皮細胞向肝細胞分化的分子機制尚未明確，其中一個重要原因是以前報道的方法誘導膽管上皮細胞向肝細胞轉(zhuǎn)變的效率太低，很難進行細胞和分子機制的深入研究。

　　本研究中，研究人員首先構(gòu)建了高效穩(wěn)定的膽管上皮細胞向肝細胞轉(zhuǎn)分化的遺傳學模型，為膽管上皮細胞向肝細胞轉(zhuǎn)分化的細胞及分子機制研究奠定基礎(chǔ)。研究人員在Fah基因中插入loxp-stop-loxp序列，構(gòu)建了Fah-loxp-stop-loxp（Fah-LSL）小鼠，阻止Fah基因的正常表達。Fah-LSL小鼠與組織特異性CreER小鼠結(jié)合可以在特定類型細胞中發(fā)生Cre-loxp同源重組，切除stop序列，使細胞恢復表達Fah基因的能力。對CK19-CreER;R26-tdT;Fah-LSL/Fah-LSL小鼠進行他莫昔芬誘導，可將膽管上皮細胞及其子代細胞標記為tdT⁺，同時在膽管上皮細胞及其子代細胞中將Fah基因中的stop序列切除，使膽管上皮細胞及其子代細胞恢復表達Fah基因的能力。之后對小鼠停止給予NTBC藥物，肝臟呈現(xiàn)嚴重損傷狀態(tài)，刺激膽管上皮細胞向肝細胞分化。該遺傳學模型從基因組水平進行全身性Fah基因敲除，不存在抑制肝細胞增殖的效率問題，因為每個肝細胞都是缺乏Fah基因的，這樣能夠高效穩(wěn)定地誘導具有表達Fah基因能力的膽管上皮細胞向肝細胞轉(zhuǎn)分化，為研究轉(zhuǎn)分化的細胞和分子機制奠定基礎(chǔ)。

　　在Fah-LSL/Fah-LSL小鼠誘導的肝損傷中，研究人員對Epcam+細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示Epcam+細胞群分為不同亞群；一群細胞高表達細胞增殖相關(guān)基因（Cdk1），定義為增殖的膽管上皮細胞群（Proliferating BECs）；一群細胞同時表達膽管上皮細胞分子標記（Krt19、Epcam）和肝細胞分子標記（HNF4a、Ttr），定義為肝臟祖細胞群（LPCs）。將上述單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與之前報道的2組DDC誘導的肝損傷中Epcam+細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行整合分析，研究人員未在DDC誘導的肝損傷中檢測到肝臟祖細胞；也未在正常肝臟中檢測到肝臟祖細胞。同時，研究人員通過免疫熒光染色實驗在Fah-LSL/Fah-LSL小鼠誘導的肝損傷中檢測到CK19+HNF4a+的肝祖細胞，并且這些細胞也表達Epcam、A6、OPN等肝臟祖細胞分子標記；而DDC誘導的肝損傷中未檢測到CK19+HNF4a+的肝祖細胞。此外，研究人員在多種人類肝臟疾病包括非酒精性脂肪性肝炎和病毒性肝炎等中發(fā)現(xiàn)肝細胞呈現(xiàn)衰老狀態(tài)，并檢測到CK19+HNF4a+肝祖細胞，發(fā)現(xiàn)肝細胞的衰老程度與肝祖細胞的產(chǎn)生呈現(xiàn)正相關(guān)聯(lián)系；并且在這些人類肝臟疾病中，膽管上皮細胞未呈現(xiàn)衰老狀態(tài)，提示在人的肝臟疾病中，膽管上皮細胞可能作為肝臟祖細胞的來源貢獻給肝細胞而發(fā)揮重要作用。

　　研究人員對單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行擬時序分析發(fā)現(xiàn)肝臟祖細胞來源于膽管上皮細胞；之后利用CK19-CreER工具小鼠標記并示蹤膽管上皮細胞，揭示膽管上皮細胞可以貢獻給肝臟祖細胞。為了研究肝臟祖細胞的分化潛能，研究人員利用雙同源重組酶介導的譜系示蹤技術(shù)來標記肝臟祖細胞，示蹤結(jié)果揭示肝臟祖細胞具有向膽管上皮細胞和肝細胞分化的潛能。值得注意的是，肝臟祖細胞不具有增殖活性，并且單個肝臟祖細胞不能同時產(chǎn)生膽管上皮細胞和肝細胞。

　　單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示肝臟祖細胞群相較于膽管上皮細胞群下調(diào)表達Hippo信號通路相關(guān)基因和Notch信號通路相關(guān)基因，提示Notch信號通路調(diào)控膽管上皮細胞向肝臟祖細胞的分化。研究人員在膽管上皮細胞中進行Rbpj基因敲除，發(fā)現(xiàn)抑制Notch信號通路能夠促進膽管上皮細胞向肝臟祖細胞分化，從而促進膽管上皮細胞向肝細胞分化。此外，研究人員利用Dibenzazepine藥物來抑制Notch信號通路也證實抑制Notch信號通路能夠促進膽管上皮細胞向肝臟祖細胞分化，從而促進膽管上皮細胞向肝細胞分化。當在膽管上皮細胞中激活Notch信號通路后，則完全抑制了膽管上皮細胞向肝臟祖細胞的分化，阻礙了肝臟再生。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示膽管上皮細胞分化產(chǎn)生的肝細胞相較于肝臟祖細胞上調(diào)表達WNT/β-catenin信號通路相關(guān)基因，提示W(wǎng)NT/β-catenin信號通路調(diào)控膽管上皮細胞向肝細胞的分化。研究人員在膽管上皮細胞中進行β-catenin基因敲除，發(fā)現(xiàn)抑制WNT/β-catenin信號通路阻礙了肝臟祖細胞向肝細胞的分化；而在膽管上皮細胞中激活WNT/β-catenin信號通路能夠促進膽管上皮細胞向肝臟祖細胞分化，促進膽管上皮細胞向肝細胞分化；并且在膽管上皮細胞中激活WNT/β-catenin信號通路后促進肝臟祖細胞中肝細胞基因以及肝細胞代謝相關(guān)基因的上調(diào)，提示激活WNT/β-catenin信號通路能夠促進肝臟祖細胞向肝細胞分化。此外，研究人員利用RSPO1重組蛋白來激活WNT/β-catenin信號通路，也能夠顯著促進膽管上皮細胞向肝細胞分化。以上研究揭示了膽管上皮細胞轉(zhuǎn)分化為肝細胞的細胞及分子調(diào)控機制，為肝臟祖細胞誘導產(chǎn)生肝細胞治療肝臟疾病的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)和研究思路。

　　分子細胞卓越中心周斌研究組副研究員蒲文娟和博士生朱歡、張銘珺為該論文的共同第一作者，周斌研究員和諾華生物醫(yī)學研究所Jan S. Tchorz博士為該論文共同通訊作者。該研究得到瑞士巴塞爾大學Heim Markus、意大利IRCCS Humanitas大學Luigi Terracciano等大力支持和幫助。該工作得到中科院、基金委、科技部和上海市科委等部門的經(jīng)費資助。

　　文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41588-023-01335-9 

雙潛能肝臟祖細胞促進肝臟再生機制

　　a, 示意圖顯示肝臟祖細胞起源于膽管上皮細胞，并在肝臟再生中貢獻給肝細胞。肝臟祖細胞是雙潛能的，可以分化為肝細胞或膽管上皮細胞，但是一個肝臟祖細胞不能同時產(chǎn)生肝細胞和膽管上皮細胞。b, 示意圖顯示抑制Notch信號能促進膽管上皮細胞向肝臟祖細胞分化，激活Notch信號則抑制這一分化過程而促進膽管上皮細胞增殖。c, 示意圖顯示抑制WNT信號削弱肝臟祖細胞向肝細胞分化，激活WNT信號會促進膽管上皮細胞向肝臟祖細胞和肝臟祖細胞向肝細胞的分化。