2月10日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Journal of Molecular Cell Biology（JMCB）在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心丁建平研究組和楊薈研究組的研究成果“Caenorhabditis elegans NMAD-1 functions as a demethylase for actin”。

　　丁建平研究組長(zhǎng)期從事真核生物表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的研究，綜合利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等手段闡釋了多種表觀修飾酶對(duì)底物識(shí)別和催化的分子機(jī)制。此次，他們報(bào)道了秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中Alkb家族蛋白NMAD-1以Fe²⁺/α-KG依賴的方式催化肌動(dòng)蛋白第84位賴氨酸單甲基化（K84me1）的去甲基化活性，并解析了NMAD-1結(jié)合底物類似物NOG和Mg²⁺的晶體結(jié)構(gòu)，為后續(xù)探究NMAD-1的生理功能提供了線索。

　　DNA N-6甲基腺嘌呤（6mA）是原核生物中廣泛存在的表觀遺傳修飾，但高等真核生物是否存在6mA修飾仍存在爭(zhēng)議。近年來(lái)，多個(gè)課題組相繼在多種不同真核生物中發(fā)現(xiàn)6mA的存在，并鑒定出多種與6mA相關(guān)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶，但除METTL4和ALKBH1兩種哺乳動(dòng)物6mA效應(yīng)蛋白外，仍有多種6mA相關(guān)修飾酶缺乏深入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲基因組存在6mA修飾，6mA的修飾水平受到DNA去甲基化酶NMAD-1和潛在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DAMT-1的共同調(diào)控。NMAD-1屬于Alkb家族，可以通過(guò)Fe²⁺/α-KG依賴的方式在體內(nèi)和體外催化單鏈DNA、雙鏈DNA上6mA修飾的去甲基化。

　　丁建平研究組和楊薈研究組合作對(duì)NMAD-1的底物特異性、功能和分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究?；隗w外結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析，他們發(fā)現(xiàn)重組NMAD-1不具有結(jié)合DNA的能力。由于NMAD-1與人源ALKBH4具有高度的同源性，而人源ALKBH4被認(rèn)為與肌動(dòng)蛋白K84me1的修飾水平相關(guān)，這激勵(lì)他們對(duì)NMAD-1是否具有肌動(dòng)蛋白去甲基化活性進(jìn)行了探索。通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)，他們發(fā)現(xiàn)野生型線蟲存在與人源肌動(dòng)蛋白K84me1同源的線蟲肌動(dòng)蛋白K85me1修飾；而在NMAD-1缺陷的突變體線蟲中，該修飾水平明顯提高（圖A），這些發(fā)現(xiàn)提示NMAD-1可能作為一類蛋白去甲基化酶，調(diào)控肌動(dòng)蛋白K85me1修飾水平。體外生化實(shí)驗(yàn)也顯示，NMAD-1能夠直接結(jié)合并催化肌動(dòng)蛋白K84me1的去甲基化（圖B，C）。他們解析了NMAD-1結(jié)合底物類似物NOG和Mg²⁺的晶體結(jié)構(gòu)（圖D）。結(jié)構(gòu)分析表明，與其他Fe²⁺/α-KG依賴的雙加氧酶類似，NMAD-1的催化核心采取一個(gè)保守的DSBH（double-stranded α-helix）折疊方式，其中金屬離子和NOG結(jié)合在位于DSBH開放一側(cè)的活性反應(yīng)中心?；钚苑磻?yīng)中心關(guān)鍵氨基酸的突變體酶活實(shí)驗(yàn)表明，NMAD-1的活性依賴于金屬離子和α-KG的正確結(jié)合。由Flip1和Flip2 基序（motif）構(gòu)成的NRL （nucleotide reorganization lid）結(jié)構(gòu)域位于DSBH開放的一側(cè)，F(xiàn)lip1和Flip2相互遠(yuǎn)離呈現(xiàn)開放的構(gòu)象，使得活性反應(yīng)中心暴露在溶液中。NMAD-1獨(dú)特的NRL結(jié)構(gòu)域與底物的識(shí)別相關(guān)。不同于其他具有DNA/RNA去甲基化酶活性的Alkb家族蛋白，NRL結(jié)構(gòu)域并未在NMAD-1的活性反應(yīng)中心附近形成帶有連續(xù)正電荷的核酸結(jié)合口袋，而是形成了一個(gè)較為疏水且開放的底物結(jié)合區(qū)域（圖E），該區(qū)域與肌動(dòng)蛋白K84位點(diǎn)附近的結(jié)構(gòu)在形狀和電荷環(huán)境上互補(bǔ)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)NMAD-1的C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）與NRL結(jié)構(gòu)域相互作用、并穩(wěn)定了NRL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。當(dāng)對(duì)NMAD-1的CTD截短后，NMAD-1活性反應(yīng)中心保持完整，但失去了結(jié)合底物肌動(dòng)蛋白的能力，造成NMAD-1對(duì)肌動(dòng)蛋白K84me1去甲基化活性的喪失（圖F），進(jìn)一步表明NRL結(jié)構(gòu)域在NMAD-1的底物識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。這些研究結(jié)果闡明了NMAD-1催化肌動(dòng)蛋白K84/85me1去甲基化的分子機(jī)制。

　　分子細(xì)胞卓越中心與上?？萍即髮W(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生石雨為該論文第一作者，丁建平研究員和楊薈研究員為該論文的共同通訊作者。該研究工作得到了國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究設(shè)施（上海）BL19U1線站、分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心分子平臺(tái)的技術(shù)支持，以及國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的經(jīng)費(fèi)支持。

　　文章鏈接：https://doi.org/10.1093/jmcb/mjad008 

NMAD-1催化肌動(dòng)蛋白K84/85me1去甲基化的分子機(jī)制