1月10日，國際學術期刊Cell Discovery在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌研究組與復旦大學附屬中山醫(yī)院王利新研究組合作的研究文章“Coronary vessels contribute to de novo endocardial cells in the endocardium-depleted heart”。該研究利用雙同源重組酶介導的譜系示蹤技術揭示了心臟冠狀血管轉變?yōu)樾膬饶さ臐撃堋?/p>
在心臟的發(fā)育過程中，冠狀血管主要來源于兩群祖細胞，第一群祖細胞為將血液循環(huán)回心臟的靜脈竇(sinus venous, SV)，另一群祖細胞則是排列在心腔內的內皮細胞層，也即心內膜(endocardium)。在小鼠的心臟中，靜脈竇來源的冠狀血管主要分布在心室壁的外側，而心內膜來源的冠狀血管主要分布在心室壁的內側。先前已有文章表明，在靜脈竇來源的冠狀血管缺失時，心內膜來源的冠狀血管能夠向外擴展并代償缺失的冠狀血管。盡管在成體心臟中，心內膜貢獻給冠狀血管的能力喪失，但在特定的損傷條件以及生長因子的刺激下，這個過程又會被重新激活，這表明了在心臟的修復與再生過程中有著強大的細胞可塑性。另外，心內膜在心臟的發(fā)育過程中會貢獻到心臟的多種細胞譜系，如成纖維細胞、周細胞、平滑肌細胞、脂肪細胞等，而且心內膜在心臟瓣膜形成及心臟正常功能維持中都起著重要作用，這些表明了心內膜在心臟生長以及穩(wěn)態(tài)維持中有著至關重要的角色。盡管近些年來心內膜向內皮細胞的轉變已經被深入研究，但冠狀血管內皮是否能逆轉回心內膜細胞仍然未知。揭示特定細胞轉換回祖細胞狀態(tài)的可塑性對干細胞研究和再生醫(yī)學應用至關重要，因此研究人員探究了冠狀血管轉換為心內膜的能力。
為了高效標記心內膜細胞，研究人員首先利用心內膜的標記物NPR3構建了Npr3-tTA的基因敲入小鼠，通過獲得Npr3-tTA;TetO-Cre;R26-lsl-tdT小鼠，其中tTA結合到TetO序列并激活下游Cre重組酶的表達，用于NPR3+心內膜細胞的譜系示蹤，對出生后第2天小鼠的心臟進行全組織熒光拍照以及免疫熒光染色拍照，在心臟左右心房以及心內膜以及室間隔中均出現(xiàn)了tdTomato+的細胞，證明了用于心內膜遺傳靶向的TetO系統(tǒng)的成功構建。先前已有研究利用白喉毒素受體(DTR)清除祖細胞來探究子代細胞轉變?yōu)樽婕毎臐撃?，因此研究人員利用Npr3-tTA;TetO-Cre系統(tǒng)去清除心內膜細胞并檢測冠狀血管內皮貢獻到心內膜細胞的潛能。由于心內膜細胞除了血管內皮細胞外還貢獻到多種其他細胞譜系，而且NPR3也表達在心外膜中，研究人員使用NPR3與泛內皮細胞的標記物CDH5的交集來特異性地清除心內膜細胞及其衍生的內皮細胞。為此，研究人員構建了Cre-loxp激活的可誘導性的內皮細胞特異性的DTR小鼠品系(Cdh5-lsl-tdT-DTR)，實驗結果證明tdTomato以及DTR的表達是Cre重組酶依賴的，并且是內皮細胞特異性的，因此表明了Cdh5-lsl-tdT-DTR小鼠品系成功構建。
通過對獲得的Npr3-tTA;TetO-Cre;Cdh5-lsl-tdT-DTR小鼠進行全組織熒光拍照以及免疫熒光染色拍照，研究人員證明了tdTomato與DTR表達在NPR3+心內膜及其衍生的內皮細胞。研究人員對新生小鼠注射白喉毒素(DT)后不同時間點進行收樣分析，通過對心內膜細胞的標記物PLVAP以及tdTomato進行染色發(fā)現(xiàn)，注射DT后第五天，幾乎所有的tdTomato+的細胞都被清除了并開始了心內膜的重塑。通過TUNEL實驗證明了DT確實誘導了大量細胞凋亡。通過對DT清除后5天的心臟連續(xù)切片進行tdTomato以及內皮細胞標記物CD31免疫熒光染色，結果表明，DT處理的小鼠心臟中會有冠狀血管與心內膜連接的現(xiàn)象，而在沒有DT處理的心臟中則沒有這樣的連接現(xiàn)象存在。這些結果表明冠狀血管可能參與心內膜的修復過程。
為了進一步探究冠狀血管是否能夠在心內膜清除的情況下貢獻到心內膜中去，研究人員利用了在新生小鼠冠狀血管中大量表達但不在心內膜表達的標志物APLN，研究人員交配得到Apln-DreER;R26-RSR-GFP; Npr3-tTA;TetO-Cre; Cdh5-lsl-tdT-DTR雙同源重組系統(tǒng)小鼠，以此在清除心內膜細胞內皮譜系的同時，將冠狀血管遺傳標記上GFP熒光蛋白。研究人員給新生期1天(P1)的小鼠給予他莫昔芬處理并在P3天給予DT處理，在P14進行收樣分析。免疫熒光染色結果表明在DT處理后的心臟中出現(xiàn)了GFP+CD31+的心內膜細胞，并通過對PLVAP免疫熒光染色證明了心腔內側GFP+的細胞確實是心內膜細胞。統(tǒng)計結果表明GFP+的冠狀血管貢獻到2.06 ±0.31%的心內膜。而在沒有DT處理的心臟中則沒有GFP+的心內膜細胞出現(xiàn)。給予R26-RSR-GFP; Npr3-tTA;TetO-Cre; Cdh5-lsl-tdT-DTR小鼠DT處理后，也沒有在心臟中發(fā)現(xiàn)GFP+的細胞出現(xiàn)，表明沒有發(fā)生Cre-rox的交叉重組，進一步證明了該系統(tǒng)的可信性。以上結果表明在心內膜清除的情況下，冠狀血管能夠轉變?yōu)樾膬饶ぜ毎?。為了進一步更詳細地探究冠狀血管向心內膜的轉變過程，研究人員給P1注射了他莫昔芬的新生小鼠在P3注射了更低劑量的DT，通過對心臟切片進行免疫熒光染色分析，在P7的心臟切片中發(fā)現(xiàn)了與心內膜相連通的GFP+的冠狀血管，并且在P14的心臟切片中發(fā)現(xiàn)了折疊進心室壁的GFP+PLVAP+的心內膜細胞以及GFP+PLVAPlow的細胞與PLVAP+的心內膜相連接的現(xiàn)象，以上這些結果都表明了血管內皮能夠動態(tài)持續(xù)轉換為心內膜細胞來參與心內膜的損傷后重建。另外，通過對P1注射了他莫昔芬的成體Apln-DreER;R26-RSR-GFP; Npr3-tTA;TetO-Cre; Cdh5-lsl-tdT-DTR小鼠進行DT處理，研究人員發(fā)現(xiàn)成體小鼠心臟的冠狀血管內皮細胞在心內膜清除后仍保持著轉變?yōu)樾碌男膬饶ぜ毎臐撃堋?/p>
綜上，周斌組研究人員構建了兩個新的小鼠品系Npr3-tTA與Cdh5-lsl-tdT-DTR來實現(xiàn)特異性清除心內膜及其衍生的內皮細胞譜系，隨后研究人員利用雙同源重組系統(tǒng)實現(xiàn)了在清除心內膜的同時示蹤冠狀血管內皮細胞，結果表明殘留的冠狀血管內皮會向心內膜遷移并與與其連通，通過進一步表達心內膜的標志物轉變?yōu)樾膬饶ぜ毎Ｔ撗芯拷沂玖斯跔钛軆绕ぜ毎a生新心內膜細胞的高度細胞可塑性，并再次證明了盡管祖細胞-衍生細胞的層次結構被建立，但在這些離散的內皮細胞類型之間的邊界可以在誘導基因程序激活時被覆蓋。
分子細胞卓越中心博士生張銘珺和副研究員蒲文娟為該論文共同第一作者。分子細胞卓越中心周斌研究員與復旦大學附屬中山醫(yī)院王利新醫(yī)生為該論文的共同通訊作者。該工作也得到了牛津大學Nicola Smart的大力支持。感謝分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術平臺對本研究的大力支持，感謝中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經費支持。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-022-00486-z
冠狀動脈內皮細胞在心內膜細胞清除后轉化為心內膜細胞
