12月16日，國際學術(shù)期刊 EMBO Reports 以Resource形式在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心鮑嵐組的最新合作研究論文“Somatosensory neurons express specific sets of lincRNAs, and lincRNA CLAP promotes itch sensation in mice”。 該研究通過單細胞測序系統(tǒng)性地分析并構(gòu)建了初級感覺神經(jīng)元中細胞類型特異性的長鏈基因間非編碼RNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）表達譜，同時揭示了細胞類型特異表達的lincRNA CLAP參與調(diào)控癢覺功能及其分子機制。
鮑嵐研究組長期對非編碼RNA在神經(jīng)元發(fā)育中的功能及其分子機制進行研究。研究組前期的研究工作發(fā)現(xiàn)，初級感覺神經(jīng)元軸突中富集的microRNAs（miRNAs）通過調(diào)控軸突中的mRNA局部翻譯參與軸突延伸（Wang et al., Cell Reports, 2015; Wang & Bao, Journal of Molecular Cell Biology, 2017）。研究組最近的研究發(fā)現(xiàn)，軸突富集的長鏈非編碼RNA（lncRNA）ALAE通過競爭RNA結(jié)合蛋白 KHSRP與Gap43 mRNA的相互作用進而調(diào)節(jié)軸突局部翻譯和軸突生長(Wei et al., Cell Reports, 2021)，lncRNA Dubr的m6A動態(tài)修飾通過穩(wěn)定RNA結(jié)合蛋白YTHDF1/3介導mRNA翻譯從而參與神經(jīng)元遷移和軸突發(fā)育（Huang et al., Cell Reports, 2022），這些研究進一步揭示了神經(jīng)元特異分布的非編碼RNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
初級感覺神經(jīng)元屬于假單極神經(jīng)元，它的胞體聚集形成背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglion，DRG）。DRG神經(jīng)元能夠把外周刺激通過脊髓進而傳至大腦，傳遞疼痛、冷熱、癢、機械和本體等多種感覺。在初級感覺神經(jīng)元中存在高度特化的不同類型神經(jīng)元，合作實驗室張旭研究員團隊前期的研究通過單細胞測序?qū)RG神經(jīng)元分為10個大類和14個亞類，同時揭示不同類型神經(jīng)元參與不同外周刺激的感覺傳遞（Li et a., Cell Research, 2016; Wang et al., Cell Research, 2021）。盡管對初級感覺神經(jīng)元的分類和功能有所了解，但神經(jīng)元類型特異的分子調(diào)控機制還遠未研究清楚。
lincRNA是一類轉(zhuǎn)錄自編碼基因間區(qū)域、缺乏蛋白翻譯能力且長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。目前多組學測序數(shù)據(jù)分析提示，在神經(jīng)系統(tǒng)中的lincRNA比mRNA具有更高的組織特異性，并可能發(fā)揮重要作用。因此，探究lincRNA在不同類型DRG神經(jīng)元中的分布、功能及作用機制對解析不同外周刺激引起感覺傳遞的分子機制有重要意義。
本研究首先通過整合分析Smart-seq2和10x Genomics的初級感覺神經(jīng)元單細胞測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了單個神經(jīng)元lincRNA的表達譜。通過計算特異性指數(shù)（Specificity measure, SPM）方法篩選并發(fā)現(xiàn)了200個細胞類型特異且高表達的lincRNA，并進一步通過單細胞PCR、原位雜交和流式分選等方法對不同細胞類型lincRNA進行了驗證。同時，還發(fā)現(xiàn)細胞類型特異的lincRNA與其基因組上臨近基因存在高度相關(guān)性，由于細胞核中定位的lincRNA能夠參與調(diào)控臨近基因的表達，提示細胞類型特異的lincRNA可能具有順式調(diào)控作用。
隨后通過對細胞類型特異性lincRNA的進化保守性分析，發(fā)現(xiàn)在生長抑素（Sst+）表達的神經(jīng)元中l(wèi)ncRNA 9130409J20Rik 特異性高表達，并且在多物種中保守性最高。利用基因共表達分析，提示lncRNA 9130409J20Rik與癢覺功能高度相關(guān)，因此我們將其命名為CLAP （Cell-type-specific LincRNA Associated with Pruritus）。進一步采用神經(jīng)元鈣成像、小鼠鞘內(nèi)注射siRNA和AAV病毒攜帶shRNA后的癢覺行為學檢測以及RNA-seq等實驗，發(fā)現(xiàn)敲低CLAP顯著抑制組胺對Sst+神經(jīng)元的激活、降低小鼠對組胺誘導的癢覺抓撓反應以及導致Sst+神經(jīng)元中與癢覺相關(guān)基因的顯著下調(diào)。最后，通過對高通量免疫共沉淀測序數(shù)據(jù)庫（CLIP-seq）分析、RNA免疫共沉淀和小鼠鞘內(nèi)注射siRNA等實驗，發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白MSI2與CLAP相互結(jié)合并參與調(diào)控CLAP對癢覺相關(guān)基因的表達。
綜上所述，本研究通過單細胞測序建立了初級感覺神經(jīng)元類型特異分布的lincRNA表達譜，揭示了細胞類型特異性表達的lincRNA在癢覺傳遞中發(fā)揮調(diào)控功能及其分子作用機制。該研究不僅有助于深入理解神經(jīng)元不同類型特異分布的lincRNA在不同軀體感覺信息傳遞中的作用和機制，而且為疼痛和慢性瘙癢等感覺相關(guān)疾病的發(fā)生機制和臨床診療提供了理論基礎(chǔ)。
廣東省智能院王斌研究員、分子細胞卓越中心鮑嵐研究組博士研究生姜博文和中科院上海營養(yǎng)與健康研究所楊力團隊博士研究生李國衛(wèi)為本文共同第一作者。鮑嵐研究員、楊力研究員和王斌研究員為共同通訊作者。這項工作得到了中科院上海高等研究院/廣東省智能科學與技術(shù)研究院張旭研究員、廣東省智能科學與技術(shù)研究院李昌林研究員、復旦大學腦科學研究院韓清見研究員和浙江大學醫(yī)學院徐貞仲研究員的大力支持。該工作得到了國家基金委、廣東省高水平創(chuàng)新研究院項目和中國醫(yī)學科學院項目的資助。
文章鏈接：https://www.embopress.org/doi/abs/10.15252/embr.202154313
單細胞測序鑒別初級感覺神經(jīng)元細胞類型特異lincRNAs
通過單細胞測序構(gòu)建初級感覺神經(jīng)元細胞類型特異lincRNA表達譜并發(fā)現(xiàn)lincRNA CLAP調(diào)控癢覺的功能和分子機制
