9月21日，國際學術(shù)期刊Cell Research在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）李勁松研究組題為“Creation of artificial karyotypes in mice reveals robustness of genome organization”的文章，報道了基于類精子干細胞介導(dǎo)半克隆技術(shù)，通過CRISPR/Cas9靶向染色體重復(fù)序列，實現(xiàn)小鼠染色體融合改造，建立全新的穩(wěn)定傳遞的染色體改造純和小鼠品系，揭示了染色體融合的機制，并提示真核生物基因組組裝的系統(tǒng)穩(wěn)健性（Robustness）是染色體演化的重要基礎(chǔ)。

　　染色體的穩(wěn)定與變化是個體生存和物種演化的基礎(chǔ)，是遺傳物質(zhì)宏觀調(diào)控規(guī)律的一體兩面，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變異常常對個體造成不利影響，而新物種的形成往往又伴隨復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)演化?；谙到y(tǒng)生物學研究，距今約3到4百萬年前，人與黑猩猩的共同祖先內(nèi)部產(chǎn)生了染色體結(jié)構(gòu)上的分異，兩條獨立的染色體通過頭對頭（類似羅氏易位，Robertsonian translocation）方式融合成為現(xiàn)代人的二號染色體（HSA2），這一改變可能直接導(dǎo)致了人類始祖與黑猩猩始祖之間的生殖隔離，成為人類物種進化的關(guān)鍵性事件。然而，這一事件發(fā)生的具體機制并不清楚。

　　實驗室常用的小鼠（Mus musculus）的核型為40條染色體，在長期配繁過程中保持染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，除Y染色體外，均為端著絲粒染色體（單臂染色體），這一點與人類染色體差異巨大，人類染色體中并未發(fā)現(xiàn)端著絲粒染色體的存在，而均以雙臂染色體形式存在（包括近端著絲粒染色體）。但是，在自然界中野生小鼠存在較為廣泛的染色體羅氏易位類型（端著絲粒染色體頭對頭融合）亞種，有趣的是，自然界中羅氏易位類型分布很不均衡，例如Rb（2，4）（2號和4號染色體融合）融合類型和Rb（5，15）等融合類型在亞洲，歐洲美洲各地廣泛分布，但是Rb（1，13）和Rb（2，9）等融合類型目前在自然界中尚未見報道。這引起了一系列思考，染色體融合是如何發(fā)生的？為什么小鼠的染色體演化存在端著絲粒偏好性？不同類型的染色體融合方式是否影響了細胞和個體的生命活動？如何可以將小鼠的單臂染色體改造成更像人類染色體的雙臂染色體？

　　2018年，中國科學家團隊在國際上率先實現(xiàn)基于酵母的大規(guī)模染色體改造，利用頭對尾的融合方式成功將酵母染色體合并為一條，為染色體重排改造研究打開了一扇窗，但是面對更為復(fù)雜的哺乳動物，在個體水平改造染色體在技術(shù)上面臨很大的困難和挑戰(zhàn)?？梢哉f在單基因突變和多基因突變遺傳均可以高效建模的今天，攻克哺乳動物染色體結(jié)構(gòu)變異建模是重要的任務(wù)，而我國科學家獨創(chuàng)的類精子干細胞技術(shù)，為實現(xiàn)哺乳動物個體水平染色體改造投來了光亮。2022年8月26日，中科院動物研究所團隊利用相似的頭對尾的融合方式成功獲得了三只19對染色體的小鼠（Science）。

　　李勁松研究團隊針對著絲粒核心基序Minor satellite（MinSat）設(shè)計了基于CRISPR/Cas9的靶向編輯方案，實現(xiàn)對著絲粒區(qū)域的靶向切割。將這樣的著絲粒靶向切割系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到小鼠類精子干細胞中，可以實現(xiàn)對小鼠兩條染色體在著絲粒區(qū)域以“頭對頭”融合的方式發(fā)生羅氏易位，形成雙臂染色體，成功模擬了自然界中在漫長演化過程中發(fā)生的染色體重排事件。研究人員從1128個轉(zhuǎn)染著絲粒切割組件的單克隆細胞系中，建立了10株具有穩(wěn)定的19條染色體的單倍體細胞系，其中有9株細胞系保持有基因組倍性平衡。

　　染色體著絲粒斷裂融合形成了一個新的著絲粒，但是有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)，所有和小鼠二號染色體（Chr2）發(fā)生羅氏移位之后形成的雙臂染色體具有兩個獨立的著絲粒（MinSat富集區(qū)域）。進一步分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，小鼠Chr2與其他染色體不同，在染色體末端就具有兩個著絲粒。由于雙著絲粒染色體會造成在有絲分裂中存在不穩(wěn)定性，容易造成染色體斷裂和基因組不穩(wěn)定性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，小鼠Chr2具有一個活化的著絲粒和一個失活的著絲粒。這一發(fā)現(xiàn)也暗示了小鼠Chr2染色體和其他染色體相比在進化歷程中存在著特殊的著絲粒形成事件。

　　染色體融合事件對于細胞的生命活動有什么樣的影響呢？研究人員對具有不同羅氏易位的細胞系進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果令人驚訝，攜帶單條羅氏易位染色體的“類精子干細胞”只具有最多不超過20個差異基因，這說明染色體“頭對頭”的融合方式對細胞表達譜擾動極小，有趣的是差異基因同時分布在參與融合和其余未參與融合的染色體上。

　　考慮到3D基因組結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄調(diào)控和進化都是重要的，研究人員考察了染色體融合對3D基因組結(jié)構(gòu)的影響。羅氏易位細胞系和Wild-type細胞系比起來，A/B compartment和TAD高度相似，此外接近90%的染色質(zhì)之間的顯著相互作用可以在羅氏易位細胞系和Wild-type細胞系中同時被檢測到。染色體融合直接拉進了兩條染色體的物理距離，表現(xiàn)為兩條染色體之間相互作用更加頻繁，有趣的是，在著絲粒區(qū)域以及端粒區(qū)域，這種相互作用增強的趨勢更加明顯。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，小鼠Chr11與其余染色體相互作用在發(fā)生染色體融合后表現(xiàn)出較強的變化，即使其未參與到染色體融合事件?？傮w來講，染色體融合對基因組結(jié)構(gòu)和基因表達調(diào)控影響較小，這也說明細胞內(nèi)基因組結(jié)構(gòu)以及表達調(diào)控存在穩(wěn)態(tài)調(diào)控，體現(xiàn)系統(tǒng)穩(wěn)健性（Robustness）。

　　類精子干細胞具有替代精子使卵母細胞“受精”的能力，將染色體融合改造的類精子干細胞注入卵子后可以產(chǎn)生健康“半克隆”小鼠，并可以通過繁育獲得攜帶純和融合染色體的小鼠品系，在實驗室條件下實現(xiàn)了哺乳動物的核型演化事件。本項研究中，研究人員一共成功建立了四個獨立的純和染色體融合小鼠品系，雌雄純和小鼠可自由配繁穩(wěn)定傳遞融合染色體。

　　接下來研究人員嘗試了在單重染色體融合的類精子干細胞上進行疊加切割，產(chǎn)生了二重甚至三重染色體融合的類精子干細胞。有趣的是，隨著染色體融合事件的疊加，細胞差異基因數(shù)目逐漸增加，這些基因同樣也分布在參與融合和未參與融合的染色體上，這暗示了染色體融合事件的累積帶來轉(zhuǎn)錄組整體水平的擾動。令人驚喜的是，多重融合的類精子干細胞作為父源遺傳物質(zhì)供體依然可以支持半克隆小鼠的產(chǎn)生，一步實現(xiàn)多重染色體融合小鼠模型的建立。

　　綜上所述，本研究證實著絲粒的斷裂導(dǎo)致的染色體融合是染色體演化的原因，真核生物基因組組裝的系統(tǒng)穩(wěn)健性（Robustness）是染色體演化的重要基礎(chǔ)。該研究也為哺乳動物進行染色體結(jié)構(gòu)的改造、動物新核型亞種的創(chuàng)造以及染色體結(jié)構(gòu)變異疾病的模擬提供了可行的技術(shù)路線，開啟了以小鼠為代表的哺乳動物染色體遺傳改造的新領(lǐng)域。

　　分子細胞卓越中心李勁松研究員為本文通訊作者，博士后張曉宇、晏萌,博士生楊振華、向浩為共同第一作者。該工作獲得分子細胞卓越中心唐蔚主管、柳欣研究員、裴鋼院士的大力支持。該工作也得到中心動物實驗技術(shù)平臺和細胞分析技術(shù)平臺的大力支持，并獲科技部、基金委、中科院以及上海市科委等部門的經(jīng)費支持。

　　文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-022-00722-x 

類精子干細胞中小鼠二號染色體和X染色體以頭對頭形式融合形成雙臂染色體

（紅色：端粒；白色：著絲粒：綠色：近著絲粒）