6月6日，國際學(xué)術(shù)期刊Journal of Cell Biology發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組研究成果“Lineage tracing clarifies the cellular origin of tissue resident macrophages in the developing heart”。該研究利用多種遺傳譜系示蹤系統(tǒng)，在小鼠體內(nèi)分別實(shí)現(xiàn)對心臟心內(nèi)膜、卵黃囊(yolk sac, YS)內(nèi)皮細(xì)胞、主動脈-性腺-中腎區(qū)（aorta-gonads-mesonephros, AGM）內(nèi)皮細(xì)胞高效率、特異性的標(biāo)記，揭示了在胚胎發(fā)育期心臟駐留型巨噬細(xì)胞主要起源于YS內(nèi)皮的初級造血（primitive hematopoiesis）和短暫次級造血（transient definitive hematopoiesis）作用以及隨后的AGM內(nèi)皮的次級造血（definitive hematopoiesis）作用。

　　心臟作為“機(jī)體發(fā)動機(jī)”對維持人類生命活動至關(guān)重要，多種心血管疾病引起的心功能失常嚴(yán)重威脅人類健康，例如心肌梗死、心肌炎癥、冠心病、高血壓等，已成為人類死亡的重要原因。心臟駐留型巨噬細(xì)胞是心臟的重要組成部分，在心臟穩(wěn)態(tài)維持和損傷再生中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，例如調(diào)控胚胎期心臟冠狀動脈血管和淋巴管新生，維持心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)正常功能，參與心臟損傷后的修復(fù)等。因此，闡明心臟巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源將會為心臟發(fā)育及臨床心臟損傷修復(fù)提供重要研究基礎(chǔ)。

　　關(guān)于心臟駐留型巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源并未完全清楚，一直存在科學(xué)爭論。多項(xiàng)研究認(rèn)為哺乳動物胚胎期組織駐留型巨噬細(xì)胞起源于早期的生血內(nèi)皮（hemogenic endothelium），主要包括YS區(qū)和AGM區(qū)生血內(nèi)皮細(xì)胞。小鼠胚胎發(fā)育期主要存在三波造血活動，第一波最早來源于胚胎發(fā)育第7.5天（E7.5）左右YS血島中的后板中胚層，產(chǎn)生早期的紅系髓系前體細(xì)胞（eythro-myeloid precursors，EMPs），能分化為CD45⁺F4/80^brightCD11b^low巨噬細(xì)胞，可遷移至大腦形成小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（microglia），這個(gè)過程稱為初級造血。第二波起源于E8.0-E8.5天的YS造血內(nèi)皮，能夠產(chǎn)生晚期的EMPs，被認(rèn)為是短暫次級造血。一旦血液循環(huán)系統(tǒng)在E8.5天左右建立，EMPs會隨著血液循環(huán)定植于胎肝，并在胎肝擴(kuò)增、分化為CD45⁺F4/80^lowCD11b^high巨噬/單核細(xì)胞。第三波來源于E10.5天左右AGM區(qū)生血內(nèi)皮產(chǎn)生的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs），稱為次級造血，這些HSCs在E10.5天左右移植于胎肝并繼續(xù)承擔(dān)造血活動，分化為包括CD45⁺F4/80^lowCD11b^high巨噬/單核細(xì)胞在內(nèi)的多種譜系血細(xì)胞。鑒定并發(fā)現(xiàn)新的造血內(nèi)皮類型一直是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近期，Haruko Nakano團(tuán)隊(duì)提出一個(gè)全新的概念，提出心臟心內(nèi)膜也屬于造血內(nèi)皮，在胚胎早期能夠進(jìn)行造血活動，貢獻(xiàn)到外周血細(xì)胞并分化為心臟駐留型巨噬細(xì)胞。在他們的報(bào)道中，首先使用Nkx2.5-Cre工具小鼠標(biāo)記心內(nèi)膜進(jìn)行譜系示蹤分析，發(fā)現(xiàn)Nkx2.5-Cre標(biāo)記的心內(nèi)膜在E9.5左右具有短暫造血活性，并且這些心內(nèi)膜來源的血細(xì)胞能進(jìn)入血液循環(huán)；之后再次利用Nfatc1-Cre工具小鼠標(biāo)記心內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行譜系示蹤分析，進(jìn)一步指出心內(nèi)膜細(xì)胞在E9.5左右開始可以分化為心臟巨噬細(xì)胞，并指出這群巨噬細(xì)胞對心臟瓣膜的發(fā)育非常重要，被清除后會引起瓣膜發(fā)育異常。需要注意的是，在譜系示蹤實(shí)驗(yàn)中，基因啟動子表達(dá)的特異性將決定著報(bào)告基因?qū)Π屑?xì)胞標(biāo)記的特異性。例如當(dāng)基因a的啟動子除了在A細(xì)胞表達(dá)外如果還表達(dá)在B細(xì)胞，那么在a-Cre;Rosa26-reporter小鼠中，報(bào)告基因會同時(shí)標(biāo)記A細(xì)胞和B細(xì)胞，這會嚴(yán)重干擾譜系示蹤結(jié)果的可靠性。所以在開展譜系示蹤實(shí)驗(yàn)前，需要對遺傳工具進(jìn)行嚴(yán)格的特異性標(biāo)記檢測，這是譜系示蹤結(jié)果可靠性的重要前提。有研究發(fā)現(xiàn)用來標(biāo)記示蹤心內(nèi)膜細(xì)胞的Nkx2.5-Cre工具小鼠是具有爭議的，Nkx2.5并不是心內(nèi)膜特異性的分子標(biāo)志物，Nkx2.5-Cre除了表達(dá)在心內(nèi)膜還“異位”表達(dá)在YS和AGM區(qū)生血內(nèi)皮。因此，揭示Nfatc1-Cre是否特異性標(biāo)記心內(nèi)膜細(xì)胞，并闡明心臟巨噬細(xì)胞發(fā)育起源這一科學(xué)爭議是亟待解決的。

　　在本研究中，周斌組研究人員首先對Nfatc1的表達(dá)譜進(jìn)行了詳細(xì)闡明。他們構(gòu)建了三種Nfatc1工具小鼠：Nfatc1-ires-Cre;R26-tdTomato, Nfatc1-2A-Dre;R26-RSR-tdTomato, 和 Nfatc1-2A-CreER;R26-tdTomato。通過利用這三種Nfatc1工具小鼠開展系統(tǒng)的譜系示蹤實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)Nfatc1除了表達(dá)在心臟心內(nèi)膜細(xì)胞，還表達(dá)在YS和AGM區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞，以及一些外周血免疫細(xì)胞中，包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。以上結(jié)果揭示Nfatc1并不是心內(nèi)膜特異性分子標(biāo)志物，其標(biāo)記的外周血巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞以及YS和AGM區(qū)的造血內(nèi)皮將會對心內(nèi)膜譜系示蹤結(jié)果產(chǎn)生極大的干擾，因此心內(nèi)膜是否屬于造血內(nèi)皮并具有造血活性仍然存在爭議。為了解決這一問題，他們引進(jìn)了兩種新的心內(nèi)膜工具小鼠：Mef2c-AHF-Cre;R26-tdTomato和Npr3-CreER;R26-tdTomato。通過系統(tǒng)的譜系示蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)Mef2c-AHF-Cre能高效率地標(biāo)記心房和流出道內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)Npr3-CreER能高效率、特異性地標(biāo)記心內(nèi)膜。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這些被標(biāo)記的心內(nèi)膜均不具備造血活性，不會分化為心臟駐留型巨噬細(xì)胞也不會標(biāo)記外周血細(xì)胞。另一方面，利用Wt1-CreER;R26-tdTomato工具小鼠特異性標(biāo)記心外膜細(xì)胞，研究人員也排除了心外膜具有造血潛能的可能性。因此，為了重新闡明心臟駐留型巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源，他們構(gòu)建了Cdh5-2A-CreER工具小鼠并驗(yàn)證其能高效率、特異性的標(biāo)記造血內(nèi)皮。通過對E7.5 Cdh5-2A-CreER;R26-tdTomato進(jìn)行四羥他莫昔芬（4OHT）誘導(dǎo)，可以高效率示蹤大腦microglia，提示YS造血內(nèi)皮的初級造血和短暫次級造血作用被特異性、高效率地捕捉；而對E10.5 Cdh5-2A-CreER;R26-tdTomato進(jìn)行4OHT誘導(dǎo)，則不會標(biāo)記大腦microglia，提示AGM造血內(nèi)皮的次級造血作用被特異性、高效率地捕捉，而不會受YS造血內(nèi)皮的干擾。然后分別收集E16.5 Cdh5-2A-CreER;R26-tdTomato胚胎心臟進(jìn)行分析，揭示在胚胎發(fā)育期心臟駐留型巨噬細(xì)胞主要起源于YS內(nèi)皮的初級造血和短暫次級造血作用（比例約90%）以及隨后的AGM內(nèi)皮的次級造血作用（比例約15%）。本研究闡明心臟駐留型巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源將為心臟發(fā)育及心臟疾病的臨床免疫治療提供重要研究基礎(chǔ)。

　　分子細(xì)胞卓越中心及中國科學(xué)院杭州高等研究院周斌研究組博士后劉擴(kuò)和博士后金恒薇為該論文共同第一作者，周斌研究員為該論文通訊作者。該研究得到分子細(xì)胞卓越中心動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺、細(xì)胞分析技術(shù)平臺和國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施的大力支持。該工作得到中國科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委等經(jīng)費(fèi)支持。

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　　圖注：胚胎發(fā)育期心臟駐留型巨噬細(xì)胞主要起源于①YS內(nèi)皮的初級造血和短暫次級造血作用以及②AGM內(nèi)皮的次級造血作用，不起源于③心內(nèi)膜細(xì)胞。