3月5日，國際學術期刊Protein & Cell 以封面論文的形式發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）李勁松研究組的研究成果“ Epigenetic integrity of paternal imprints enhances the developmental potential of androgenetic haploid embryonic stem cells ”。這項工作首次實現小鼠孤雄單倍體胚胎干細胞在體外培養(yǎng)過程中穩(wěn)定維持父源印記的表觀完整性，并進一步提升了該細胞支持半克隆胚胎發(fā)育的潛能。

　　2008年，Austin Smith團隊建立了添加Mek1/2抑制劑和Gsk3β抑制劑（2i）的胚胎干細胞（ESCs）培養(yǎng)環(huán)境，這種培養(yǎng)基可以使體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞獲得較好的多能性（pluripotency），極大的推動了小鼠胚胎干細胞研究進程。而然，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對于2i培養(yǎng)環(huán)境的細胞進行甲基化測序后發(fā)現，由于對Mek1/2信號通路的抑制，這種細胞中的DNA甲基化模式受到了明顯的抑制，其中也包括印記調控區(qū)域的甲基化模式，進而嚴重降低了細胞的發(fā)育潛能。

　　2012年，李勁松研究組利用2i培養(yǎng)體系建立了孤雄單倍體胚胎干細胞（又稱為類精子干細胞），該細胞可以替代精子支持小鼠胚胎的發(fā)育產生半克隆小鼠。但在2i培養(yǎng)環(huán)境中，類精子干細胞的印記調控區(qū)域DNA甲基化會在培養(yǎng)過程中逐漸丟失，嚴重降低了半克隆小鼠的發(fā)育潛能（2%的半克隆胚胎發(fā)育成健康個體），極大的限制了這項技術的應用和發(fā)展。2015年，通過在類精子干細胞中敲除兩個父源印記調控區(qū)域（H19-DMR和IG-DMR）來模擬其甲基化，極大的提高了半克隆小鼠的發(fā)育潛能（20%的出生率），但是這種遺傳敲除的策略會給其后的應用帶來不確定因素。

　　為了解決上述問題，研究人員嘗試對于類精子干細胞的建系和培養(yǎng)過程進行優(yōu)化，試圖在體外培養(yǎng)過程中實現父源印記表觀修飾的穩(wěn)定維持。為此，研究人員對比分析了三種常用的小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)環(huán)境（S/L,2i/L和a2i/L）的優(yōu)缺點，并選擇a2i/L培養(yǎng)環(huán)境進行進一步的改造和優(yōu)化，最終建立了基于a2i/L培養(yǎng)環(huán)境的兩步建系的策略（TSa2i）。該策略建立的類精子干細胞在接近60代的培養(yǎng)過程中可以穩(wěn)定維持父源印記表觀修飾的完整性，同時大幅提高了健康半克隆小鼠的出生效率（最高可以達到30%）。

　　此外，研究人員還發(fā)現培養(yǎng)到后期代數的類精子干細胞印記甲基化水平進一步升高，并伴隨體內發(fā)育能力的增強。究其原因，研究人員發(fā)現TSa2i的類精子干細胞H19-DMR的甲基化水平表現出異質性，大部分細胞維持高甲基化而少量細胞會逐漸丟失甲基化。有意思的是，H19-DMR甲基化水平高的細胞較低甲基化水平的細胞有增殖的優(yōu)勢，從而使這些細胞在整體中數量增多，導致類精子干細胞能穩(wěn)定維持印記甲基化并出現后期代數細胞甲基化水平升高的現象。

　　基因組印記對于胚胎干細胞體內發(fā)育能力起決定性作用，這項工作首次建立了能長期穩(wěn)定維持雄性印記的類精子干細胞，并提升其發(fā)育潛能，為體內遺傳篩選提供強大的工具，該研究也為建立穩(wěn)定維持印記的孤雌單倍體胚胎干細胞提供了新的思路。

　　分子細胞卓越中心博士生張紅玲，博士后李元元和博士生馬永健為本文共同第一作者。李勁松研究員為本文的通訊作者。該研究得到分子細胞卓越中心GTP研發(fā)中心，動物實驗技術平臺和細胞分析技術平臺的大力支持。該工作得到中國科學院、基金委、科技部、上海市科委等經費支持。

　　文章鏈接：https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-021-00890-3 

模式圖：父源印記的表觀遺傳完整性增強了AG-haESCs的發(fā)育潛能