2月4日，國際學術(shù)期刊Circulation Research 以封面文章發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心周斌研究組和海南大學駱清銘研究組題為“Extension of Endocardium-derived Vessels Generate Coronary Arteries in Neonates” 的最新研究成果。在該研究中，他們發(fā)現(xiàn)了新生期小鼠冠狀動脈生成的新方式，心內(nèi)膜來源的管狀結(jié)構(gòu)通過向外擴張、動脈化等一系列過程生成橫跨心臟內(nèi)外側(cè)壁的心肌層冠狀動脈，而這一過程受到Mettl3和Notch信號通路的調(diào)控。生成的冠狀動脈可以持續(xù)到成年，在心臟損傷如心肌梗死中發(fā)揮重要的保護作用。該研究利用多種單/雙同源重組酶介導的譜系示蹤技術(shù)，并結(jié)合熒光顯微光學切片斷層成像fMOST技術(shù)，清晰地展示了新生期小鼠心臟中冠狀動脈生成新方式，為損傷心臟的血管修復和治療提供新的研究方向，也為心血管再生醫(yī)學提供了新思路。
冠狀動脈疾病發(fā)病率近年來一直呈上升態(tài)勢，如今已經(jīng)成為人類健康的頭號殺手。冠狀動脈疾病患者大多數(shù)喪失勞動力，其中心肌梗死的致殘率達到50%，嚴重危害人民的生命和健康。冠狀動脈可以向心臟供給氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而維持心臟正常的生理功能。然而，當冠狀動脈發(fā)生病變，如血管壁發(fā)生動脈粥樣硬化，管腔迅速發(fā)生持久而完全的閉塞，導致冠狀動脈供血急劇減少或者中斷，使相應(yīng)的心肌持久而嚴重地急性缺血，從而引發(fā)心肌梗死。關(guān)于冠狀動脈疾病引起心肌梗死和心衰的研究很多，如何提高損傷心臟的供血機能已是該領(lǐng)域的研究熱點。因此，揭示冠狀動脈的生成方式，闡明冠狀動脈形成的分子機制，將有助于人們進一步了解冠狀動脈疾病，并為心臟損傷后血管新生治療提供新的策略或方法。
目前認為，發(fā)育過程中心臟的冠狀動脈內(nèi)皮細胞主要來源于靜脈竇和心內(nèi)膜。由靜脈竇來源的冠狀血管，定義為第一群冠狀血管群（1st CVP），主要分布在心臟的外側(cè)心肌壁。而心內(nèi)膜來源的血管（2nd CVP）主要分布在心臟的內(nèi)側(cè)心肌壁以及室間隔。這些不同來源的血管內(nèi)皮細胞經(jīng)過增殖、分化及重塑等過程形成冠狀血管叢。目前觀點認為，冠狀動脈主要由第一群冠狀血管內(nèi)皮遷移、聚集、合并及動脈化形成，新生期心臟的冠狀動脈形成是否有其他新的生成方式仍需進一步研究。為了系統(tǒng)地研究新生期心臟中冠狀動脈血管發(fā)育過程和生成方式，研究者首先利用Tie2 Cre;CX40-LSL-GFP雙譜系示蹤系統(tǒng)，結(jié)合組織透明化及光片熒光顯微成像處理，清晰地解析了冠狀動脈在新生期小鼠心臟中的發(fā)育過程。研究者發(fā)現(xiàn)，新生小鼠心臟中的心肌層中的冠狀動脈數(shù)量會隨著心臟的發(fā)育而增多，隨著時間的推移，比較出生后3天和出生后7天的小鼠心臟，會發(fā)現(xiàn)這一過程中心臟內(nèi)側(cè)壁的冠狀動脈明顯增多，那這些冠狀動脈來源于哪里呢？這為研究者進一步的研究提供了方向。
前期相關(guān)研究認為，冠狀動脈主要由分散的內(nèi)皮細胞通過血管新生、遷移、聚集、重塑形成。在胚胎期，1st CVP的內(nèi)皮細胞可以通過遷移、融合、分化為冠狀動脈。為了標記這一群來源的冠狀血管，研究者構(gòu)建了Apln-CreER小鼠，通過譜系示蹤發(fā)現(xiàn)1st CVP冠狀動脈主要分布在心臟外側(cè)壁心肌層中，并在出生后一周隨著心臟發(fā)育進一步擴張。通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在出生后7天的心臟中，1st CVP和2nd CVP的血管內(nèi)皮細胞分別位于心臟心室壁外側(cè)和內(nèi)側(cè)。但發(fā)現(xiàn)在1st CVP區(qū)域出現(xiàn)了一些未被Apln標記的冠狀動脈，而這些未被Apln標記的冠狀動脈持續(xù)到成體小鼠心臟。利用Apj CreER譜系示蹤小鼠，研究人員發(fā)現(xiàn)了同樣的情況。這群存在于心臟1stCVP區(qū)域內(nèi)但未被Apln/Apj-Cre標記的冠狀動脈來源于哪里呢？為了研究這一群冠狀動脈來源，研究者利用心內(nèi)膜特異性的Npr3-CreER小鼠進行譜系示蹤，檢測心內(nèi)膜是否貢獻到這一群特殊的冠狀動脈內(nèi)皮細胞。他莫昔芬誘導處理懷孕13.5天的小鼠，收集出生后0天到28天的小鼠心臟樣本，對出生后3天和 5天的樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)在心臟1st CVP 區(qū)域存在心內(nèi)膜來源的管道或索道狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過染色發(fā)現(xiàn)，這一群細胞既不表達成熟血管標記FABP4和Pdgfb，也沒有招募血管平滑肌細胞，因此并不是冠狀動脈。而檢測出生后7天、14天、28天以及成體小鼠心臟樣本，可以發(fā)現(xiàn)在1st CVP 區(qū)域存在心內(nèi)膜來源的冠狀動脈。研究者將出現(xiàn)在出生后3天和5天的這一特殊結(jié)構(gòu)稱為“前體冠狀動脈索道”。研究者進一步發(fā)現(xiàn)，前體冠狀動脈索道相較于周邊的血管內(nèi)皮，具有更高的細胞外基質(zhì)基因和動脈形態(tài)發(fā)生的相關(guān)基因的表達，而且出生后5天以后才能夠具有成熟的血管功能，能夠完全連接到循環(huán)系統(tǒng)。綜上，研究者確定了1st CVP 區(qū)域存在心內(nèi)膜來源的冠狀動脈，而這一動脈是由心內(nèi)膜來源的前體冠狀動脈索道向外延伸生成的。為了進一步證明這一結(jié)論，研究者將譜系示蹤技術(shù)和透明化技術(shù)相結(jié)合，收集他莫昔芬誘導處理的Npr3-CreER小鼠心臟，在整體心臟中清晰地觀察到前體冠狀動脈索道在出生后五天的小鼠心臟外側(cè)肌肉層出現(xiàn)，更多的被標記的冠狀動脈出現(xiàn)在出生后7天以及28天。綜上，心內(nèi)膜形成了1st CVP 區(qū)域早期的前體冠狀動脈索道，隨著心臟的發(fā)育過程，前體冠狀動脈索道通過隨后的動脈化形成成熟的冠狀動脈，將1st CVP和2nd CVP兩個不同起源的冠狀血管群有效連接在一起。
為了進一步闡明這種由心內(nèi)膜來源內(nèi)皮細胞向外側(cè)心肌層遷移并形成的冠狀動脈過程，研究者采用了熒光顯微光學切片斷層成像（fMOST）方法，對動脈形成過程進行了更為精細的完整心臟單細胞水平的成像。研究者將樣本處理成1.0 μm厚度，然后用水鏡進行成像。依據(jù)不同心臟大小，整個數(shù)據(jù)持續(xù)21-74小時，覆蓋整個心臟的1700-5500張冠狀面。數(shù)據(jù)經(jīng)過一系列的處理重建，發(fā)現(xiàn)出生后5天的小鼠心臟心室壁外側(cè)中出現(xiàn)前體冠狀動脈索道，而出生7天后的心臟心室壁外側(cè)中出現(xiàn)成熟的冠狀動脈血管。研究者利用亞微米分辨率（0.320.321μm3）進行三維重建心臟的橫向視圖，可以清晰地看到形成冠狀動脈的前體冠狀動脈索道。為了進一步確認生成的是一群具有功能的成熟冠狀動脈，研究者收集Npr3-CreER;R26-tdTomato;Cx40-GFP 心臟，通過fMOST成像可以清晰地看到前體冠狀動脈索道生成的冠狀動脈能連接1st 和 2nd CVPs，共同形成心臟的循環(huán)系統(tǒng)。
在分子機制方面，研究者通過一系列組織特異性基因敲除的遺傳學方法，闡明了Mettl3和Notch信號通路可以調(diào)節(jié)前體冠狀動脈索道的形成，從而調(diào)控著發(fā)育心臟中這一群特殊的冠狀動脈數(shù)量。心內(nèi)膜特異性Mettl3敲除后，心臟出現(xiàn)了更多的冠狀動脈；而在Mettl3敲除基礎(chǔ)上再敲除Notch信號通路Dll4或者Rbpj基因，心臟的冠狀動脈形成明顯減少，提示Mettl3-Notch信號通路調(diào)控心內(nèi)膜來源的冠狀動脈生產(chǎn)。進一步功能研究，研究者檢測了這一群冠狀動脈的心臟損傷修復中是否有作用，利用結(jié)扎冠狀動脈左前降支構(gòu)建了心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)心內(nèi)膜來源的前體冠狀索道生成的冠狀動脈數(shù)量的增加和減少都會影響著心肌梗死后心臟功能的改變。綜上，研究者發(fā)現(xiàn)心內(nèi)膜來源的前體冠狀索道結(jié)構(gòu)，可以經(jīng)過動脈化后形成具有功能的冠狀動脈，這一群冠狀動脈連接出生后心臟的兩個冠狀血管群，而這一過程收到Mettl3和Nocth 信號通路的精細調(diào)控，同時這一群冠狀動脈對成體心臟損傷后心臟功能的維持起著重要作用。
分子細胞卓越中心唐娟博士（現(xiàn)同濟大學研究員）、博士生朱歡以及田雪瑩博士（現(xiàn)暨南大學研究員）為該論文共同第一作者。分子細胞卓越中心周斌研究員和海南大學駱清銘教授為該論文共同通訊作者。華中科技大學龔輝教授、牛津大學Nicola Smart教授、復旦大學附屬中山醫(yī)院顏彥教授、分子細胞卓越中心童明漢研究員、西湖大學何靈娟研究員等也為該項研究提供了支持和幫助。該研究得到分子細胞卓越中心動物實驗技術(shù)平臺、細胞分析技術(shù)平臺和國家蛋白質(zhì)科學研究（上海）設(shè)施的大力支持。該工作得到中國科學院、基金委、科技部、上海市科委等經(jīng)費支持。
文章鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCRESAHA.121.320335
Circulation Research封面：新生期第7天Tie2-Cre;Cx40-LSL-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟熒光圖片，其中綠色熒光信號代表冠狀動脈內(nèi)皮細胞。
