2月1日，國際學(xué)術(shù)期刊Circulation在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組與上海胸科醫(yī)院何奔研究組合作的研究文章“Genetic Proliferation Tracing Reveals a Rapid Cell Cycle Withdrawal in Preadolescent Cardiomyocytes”。該項(xiàng)工作利用一種可以長時(shí)程不間斷捕捉體內(nèi)細(xì)胞增殖的技術(shù)—ProTracer，在體內(nèi)繪制了哺乳動(dòng)物出生后至青春期心肌細(xì)胞的增殖圖譜。

　　心血管疾病是造成人類疾病死亡的重要原因，并且發(fā)病率持續(xù)增長。心臟再生研究一直是領(lǐng)域內(nèi)的前沿科學(xué)問題及研究熱點(diǎn)。心臟再生研究的關(guān)鍵是心肌細(xì)胞的再生。新生期心肌細(xì)胞具有旺盛的增殖能力，能夠完成心臟損傷修復(fù)；但是過了新生期心臟再生能力顯著下降。關(guān)于出生后到青春期小鼠心肌細(xì)胞增殖能力的動(dòng)態(tài)變化并不十分清楚。前期研究中，科學(xué)家通過測量心臟體積及心肌細(xì)胞數(shù)量等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠心肌細(xì)胞在出生后第14天至15天會(huì)有一個(gè)增殖頂峰，能夠新產(chǎn)生大量心肌細(xì)胞，并且這個(gè)增殖過程受到甲狀腺激素調(diào)控。隨后，兩個(gè)研究組利用EdU或BrdU摻入法和細(xì)胞增殖分子標(biāo)記（Aurora B、Ki67等）染色法等實(shí)驗(yàn)手段并沒有在小鼠出生后第14至第15天中觀察到明顯心肌細(xì)胞增殖頂峰。科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在出生后小鼠心肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的事件中，心肌細(xì)胞細(xì)胞分裂占30%，多核化占57%，多倍體化占13%；并且心肌細(xì)胞細(xì)胞分裂主要發(fā)生在出生后一周，且在出生后快速下降；多核化現(xiàn)象在出生后第七天達(dá)到高峰；接著心肌細(xì)胞多倍體化開始，在出生后第14天達(dá)到高峰。然而，依賴特定時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞增殖來推斷是否存在青春期前心肌細(xì)胞增殖高峰存在技術(shù)上的難度，因?yàn)槊總€(gè)小鼠的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)并不一致，并且受到飼養(yǎng)環(huán)境、性別、產(chǎn)仔數(shù)量等多因素影響，所以捕捉一個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞增殖高峰存在一定難度，在世界上不同的實(shí)驗(yàn)室也得到不一致的結(jié)果，并可能存在重復(fù)性差的技術(shù)問題。

　　以上關(guān)于心肌細(xì)胞增殖的研究主要利用測量法、EdU或BrdU摻入法和細(xì)胞增殖的分子標(biāo)記（Aurora B、Ki67等）染色法。這些方法只能研究某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)（或者非常短時(shí)間段）的細(xì)胞增殖，不適合研究某一段時(shí)間內(nèi)（如幾周到幾月）的細(xì)胞增殖。并且這些方法無差別標(biāo)記所有細(xì)胞的增殖，不能特異性標(biāo)記某一類型細(xì)胞的增殖；而新生期心臟中非心肌細(xì)胞增殖數(shù)量及比例遠(yuǎn)高于心肌細(xì)胞增殖，且心臟組織中非心肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞緊密纏繞在一起，這些非心肌的增殖信號(hào)會(huì)顯著干擾科研人員對心肌細(xì)胞增殖的準(zhǔn)確觀察和統(tǒng)計(jì)。在小鼠體內(nèi)，新生期心肌細(xì)胞具有旺盛的增殖能力，而成體心肌細(xì)胞幾乎不具有增殖能力，小鼠出生后心肌細(xì)胞的增殖能力具體是如何變化的尚不明確，因此利用遺傳譜系示蹤技術(shù)特異性標(biāo)記出生后增殖的心肌細(xì)胞來詳細(xì)地描述新生期心肌細(xì)胞的增殖過程十分重要。

　　ProTracer (R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-GFP)技術(shù)可以用來長時(shí)程不間斷地捕捉體內(nèi)細(xì)胞增殖事件。在R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-GFP小鼠中，DreER廣泛表達(dá)在大部分細(xì)胞中，在他莫昔芬的誘導(dǎo)下發(fā)生Dre-rox重組反應(yīng)切除ER元件，將Ki67-CrexER轉(zhuǎn)變?yōu)?i>Ki67-Cre小鼠。此后，當(dāng)該細(xì)胞發(fā)生增殖的時(shí)候，就會(huì)表達(dá)Ki67并啟動(dòng)Cre同源重組酶，發(fā)生Cre-loxP同源重組反應(yīng)，將細(xì)胞永久標(biāo)記為GFP。因此，研究人員利用ProTracer技術(shù)可以標(biāo)記他莫昔芬誘導(dǎo)后的時(shí)間段內(nèi)所有增殖過的細(xì)胞。研究人員分別在小鼠出生后第0天、第6天、第12天和第18天對小鼠進(jìn)行他莫昔芬注射，并在給藥后第6天收集小鼠心臟組織。利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測不同時(shí)間點(diǎn)心臟組織中GFP⁺心肌細(xì)胞的比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著小鼠年齡的增長，心肌細(xì)胞的增殖能力是快速下降的。對上述時(shí)間點(diǎn)收集的心臟組織進(jìn)行冰凍切片及GFP和TNNI3免疫熒光染色，并統(tǒng)計(jì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)心臟組織中 GFP⁺TNNI3⁺心肌細(xì)胞的數(shù)目，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流式結(jié)果一致。

　　為了避免非心肌細(xì)胞的增殖信號(hào)干擾實(shí)驗(yàn)人員客觀地對心肌細(xì)胞增殖能力的檢測，科研人員利用Tnnt2-mTnG工具小鼠構(gòu)建了心肌細(xì)胞特異性的細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)(R26-DreER;Ki67-CrexER;Tnnt2-mTnG)。他莫昔芬誘導(dǎo)后，如果細(xì)胞發(fā)生增殖，就會(huì)表達(dá)Ki67并啟動(dòng)Cre同源重組酶的表達(dá)，發(fā)生Cre-loxP同源重組反應(yīng)，將心肌細(xì)胞標(biāo)記為mTnG，而增殖的非心肌細(xì)胞則不會(huì)被標(biāo)記上。同樣地，研究人員分別在R26-DreER;Ki67-CrexER;Tnnt2-mTnG小鼠出生后第0天、第6天、第12天和第18天對小鼠進(jìn)行他莫昔芬注射，并在給藥后第6天收集小鼠心臟組織。對收集的心臟組織進(jìn)行冰凍切片及tdTomato、GFP和TNNI3免疫熒光染色，并統(tǒng)計(jì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)心臟組織中mTnG⁺TNNI3⁺心肌細(xì)胞的數(shù)目，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著小鼠年齡的增長，心肌細(xì)胞的增殖能力是快速下降的。

　　前面兩種方式主要依賴Ki67來標(biāo)記增殖的細(xì)胞，為了從不同角度來標(biāo)記增殖細(xì)胞，科研人員利用另外一個(gè)細(xì)胞增殖的標(biāo)記Ccna2來開展研究。研究人員構(gòu)建了基于Ccna2-CrexER工具小鼠的細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)(R26-DreER;Ccna2-CrexER;R26-GFP)。分別在小鼠出生后第0天、第6天、第12天和第18天對小鼠進(jìn)行他莫昔芬注射，并在給藥后第6天收集小鼠心臟組織。對收集的心臟組織進(jìn)行冰凍切片及GFP和TNNI3免疫熒光染色，并統(tǒng)計(jì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)心臟組織中GFP⁺TNNI3⁺心肌細(xì)胞的數(shù)目，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著小鼠年齡的增長，心肌細(xì)胞的增殖能力是快速下降的。該研究提供了小鼠出生后到青春期中每一個(gè)時(shí)間段的具體心肌細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)，精確計(jì)算了每一個(gè)時(shí)間段中心肌細(xì)胞增殖比例及其增殖能力下降的速度，證明在出生后第12天到第18天心肌細(xì)胞增殖快速下降，提示心肌細(xì)胞增殖不會(huì)在第14天到15天形成一個(gè)新的高峰。

　　該項(xiàng)工作利用細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)ProTracer不間斷地記錄了小鼠出生后不同階段內(nèi)細(xì)胞的增殖活性，詳細(xì)地繪制了小鼠出生后至青春期過程中細(xì)胞增殖圖譜。研究人員觀察到小鼠出生后至青春期過程中，心肌細(xì)胞的增殖能力是快速減弱的，并且在出生后第14至第15天中沒有心肌細(xì)胞增殖頂峰出現(xiàn)。本項(xiàng)目的完成不僅揭示了哺乳動(dòng)物新生期心肌細(xì)胞的增殖能力變化，并且為研究心肌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控機(jī)制提供了有力的工具支持。

　　分子細(xì)胞卓越中心蒲文娟副研究員和博士生張銘珺為該論文共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心周斌研究員和上海胸科醫(yī)院何奔教授為該論文共同通訊作者。該研究也得到了香港中文大學(xué)的呂愛蘭教授和西湖大學(xué)何靈娟研究員的大力支持和幫助。該研究得到了分子細(xì)胞卓越中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)、細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)和國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施的大力支持。該工作得到中國科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委等經(jīng)費(fèi)支持。

　　文章鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.121.057019

圖：細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)揭示哺乳動(dòng)物出生后至青春期心肌細(xì)胞的增殖活力迅速下降

　　A，基于Ki67-CrexER工具小鼠的細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)構(gòu)建策略圖。B，實(shí)驗(yàn)策略圖。C，流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測不同時(shí)間點(diǎn)GFP⁺心肌細(xì)胞的比例來分析心肌細(xì)胞的增殖情況，右側(cè)為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。D收集不同時(shí)間點(diǎn)心臟組織進(jìn)行冰凍切片及GFP與TNNI3免疫熒光染色。并統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)心臟樣本中GFP⁺心肌細(xì)胞的數(shù)量。E，Tnn2-mTnG工具小鼠的構(gòu)建策略圖，及ACTB-Cre;Tnn2-mTnG小鼠心臟tdTmato、GFP和TNNI3免疫染色結(jié)果。F，基于Tnnt2-mTnG工具小鼠的心肌細(xì)胞特異性的細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)構(gòu)建策略圖。G，收集心肌細(xì)胞特異性的細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)小鼠不同時(shí)間點(diǎn)心臟組織進(jìn)行冰凍切片及tdTmato、GFP和TNNI3免疫熒光染色。并統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)心臟樣本中mTnG⁺心肌細(xì)胞的數(shù)量。H，基于Ccna2-CrexER工具小鼠的細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)構(gòu)建策略圖。I，收集不同時(shí)間點(diǎn)心臟組織進(jìn)行冰凍切片及GFP與TNNI3免疫熒光染色。并統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)心臟樣本中GFP⁺心肌細(xì)胞的數(shù)量。