12月23日， 國際著名學(xué)術(shù)期刊Molecular Cell在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）陳玲玲研究組關(guān)于環(huán)形RNA的最新研究進(jìn)展：“RNA circles with minimized immunogenicity as potent PKR inhibitors”。通過對不同方式體外合成環(huán)形RNA的特性深入比較分析，該研究闡明了體外合成環(huán)形RNA免疫原性的問題及分子機制，并發(fā)現(xiàn)無免疫原性且具有雙鏈結(jié)構(gòu)的環(huán)形RNA能夠高效抑制天然免疫因子PKR的激活，揭示體外合成環(huán)形RNA用于治療PKR異常激活相關(guān)自身免疫疾病的應(yīng)用潛能。該工作為進(jìn)一步研究環(huán)形RNA在天然免疫中的功能及機制奠定基礎(chǔ)，并為利用環(huán)形RNA進(jìn)行炎癥性自身免疫病的干預(yù)治療提供了新途徑。

　　大多數(shù)環(huán)形RNA來自外顯子反向剪接，以共價鍵形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)這類分子具有獨特的生成加工過程，不同于線性RNA的折疊構(gòu)象，并具有高穩(wěn)定性。這些特色使得環(huán)形RNA在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要功能，包括參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、天然免疫調(diào)控等 (詳見綜述 Chen, Nat Rev Mol Cell Biol 2020)，并且具有獨特的應(yīng)用潛能，如環(huán)形RNA通過雙鏈區(qū)域能夠抑制PKR的異常磷酸化 (Liu et al., Cell 2019)，可以作為翻譯載體用于功能性蛋白質(zhì)的表達(dá) (Wesselhoeft et al., Nat Commun 2018; Mol Cell 2019) 等。

　　需要指出的是，研究體外合成環(huán)形RNA的潛在應(yīng)用需關(guān)注兩個重要問題，一是如何提高體外合成環(huán)形RNA的效率，二是合成的環(huán)形RNA是否具有免疫原性。一方面，近期研究報道指出體外合成的環(huán)形RNA能夠被天然免疫受體RIG-I所識別，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)天然免疫反應(yīng) (Chen et al., Mol Cell 2017; Mol Cell 2019)；而另一方面，也有研究者認(rèn)為體外合成的環(huán)形 RNA 無免疫原性 (Wesselhoeft et al., Mol Cell 2019)，并指出細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)是由于環(huán)形RNA中存在微量線性RNA的污染導(dǎo)致。

　　為闡明這些重要問題，陳玲玲團隊首先比較了不同方式體外合成環(huán)形RNA的效率及免疫原性。目前已知體外合成環(huán)形RNA主要有兩種途徑：基于T4 RNA連接酶的催化直接分子內(nèi)連接成環(huán)，以及基于I型內(nèi)含子核酶進(jìn)行自剪接成環(huán)。實驗結(jié)果表明，T4 RNA連接酶合成的環(huán)形RNA，包括可作為核酸適配體的環(huán)形RNA和可翻譯的環(huán)形RNA，均不會引起細(xì)胞內(nèi)天然免疫反應(yīng)，然而通過兩種不同I型內(nèi)含子T4 bacteriophage和Anabeana自剪接形成的環(huán)形RNA均能夠引起細(xì)胞內(nèi)天然免疫反應(yīng)。

　　進(jìn)一步對不同環(huán)化方式合成的環(huán)形RNA進(jìn)行序列和二級結(jié)構(gòu)的比較分析發(fā)現(xiàn)，基于T4 RNA連接酶合成的環(huán)形RNA，僅引入1到3個外源核苷酸，然而兩種I型內(nèi)含子體外自剪接形成的環(huán)形RNA會分別引入74個或186個外源核苷酸?？蒲腥藛T利用改進(jìn)的circSHAPE-MaP技術(shù) (Liu et al., Cell 2019) 進(jìn)一步解析了不同途徑合成的環(huán)形RNA二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這些外源序列的引入會改變目的環(huán)形RNA的折疊構(gòu)象，如與環(huán)形RNA內(nèi)部序列配對，或外源序列自身形成了穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說明，I型內(nèi)含子自剪接成環(huán)引入的外源序列可能是導(dǎo)致體外合成環(huán)形RNA引起細(xì)胞內(nèi)天然免疫反應(yīng)的原因。

　　陳玲玲研究組前期工作發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE) 病人來源的PBMC或T細(xì)胞中過表達(dá)含有16-26bp短的雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)源環(huán)形RNA可抑制PKR及疾病標(biāo)志基因的異常激活 (Liu et al., Cell 2019)，提示體外合成無免疫源性且含有短的雙鏈結(jié)構(gòu)的環(huán)形RNA有望成為治療自身免疫疾病的全新手段。目前已報道的抑制PKR異常磷酸化激活的小分子化合物，如 2-Aminopurine (2-AP)，oxindole/imidazole derivative compound 16 (C16) 等，均存在一定的局限性。例如，2‐AP存在其它激酶的非特性抑制，而C16 會被體內(nèi)快速代謝清除且影響細(xì)胞正常增殖。研究人員發(fā)現(xiàn)通過T4 RNA連接酶合成的環(huán)形RNA，不僅免疫原性低，且保留了和體內(nèi)相似的16-26bp短的雙鏈結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步實驗證明，這類體外合成的環(huán)形RNA仍然能夠在體外及細(xì)胞內(nèi)抑制PKR的激活，并且相對于小分子抑制劑具有約千倍以上更好的抑制效果。

　　綜上，該研究為進(jìn)一步應(yīng)用體外合成的環(huán)形RNA奠定了重要基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研發(fā)基于環(huán)形RNA技術(shù)的核酸適配體和基因治療領(lǐng)域帶來可期前景。

　　分子細(xì)胞卓越中心玲玲研究組博士后劉楚霄博士和博士研究生郭思坤為該論文的共同第一作者，陳玲玲研究員為該論文的通訊作者。這項工作得到了中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究院楊力研究員，陳玲玲組博士研究生徐奕鋒和楊力組南芳博士的大力支持，并得到來自中科院、科技部、基金委、HHMI以及科學(xué)探索獎的支持。

　　文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276521010091 

體外合成環(huán)形RNA的免疫原性機制和潛在應(yīng)用