12月21日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Circulation發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌組、上海交通大學(xué)新華醫(yī)院孫錕教授以及香港中文大學(xué)呂愛(ài)蘭教授合作的研究成果“Seamless Genetic Recording of Transiently Activated Mesenchymal Gene Expression in Endothelial Cells During Cardiac Fibrosis”。該研究利用遺傳譜系示蹤技術(shù)無(wú)縫隙記錄心臟內(nèi)皮細(xì)胞中間充質(zhì)基因的激活，揭示了胚胎期心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程（Endothelial to Mesenchymal Transition, EndoMT），發(fā)現(xiàn)在成體心臟損傷后纖維化過(guò)程中，大量的肌成纖維細(xì)胞不是由內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)EndoMT形成，而是來(lái)源于成纖維細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)變形成的，其過(guò)程有間充質(zhì)基因的瞬時(shí)表達(dá)。

　　近20年來(lái)，關(guān)于成體心臟纖維化過(guò)程中肌成纖維細(xì)胞的來(lái)源一直存在爭(zhēng)論，前期代表性研究發(fā)現(xiàn)成體心臟纖維化中內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)通過(guò)EndoMT轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細(xì)胞（Zeisberg et al., Nature Medicine 2007），形成大量的肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)心臟纖維化，成為治療心臟纖維化的一個(gè)重要靶點(diǎn)。該結(jié)論主要是基于Cre-loxP單同源重組酶的譜系示蹤技術(shù)，存在時(shí)空分辨率較低，并可能有示蹤假陽(yáng)性的技術(shù)問(wèn)題。此外，目前也沒(méi)有技術(shù)能研究在成體心臟纖維化中內(nèi)皮細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生可逆的EndoMT，短暫或瞬時(shí)地表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的基因，由于缺乏研究手段并不清楚。

　　基于雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)（He et al., Nature Medicine 2017），研究人員建立了無(wú)縫隙捕捉間充質(zhì)基因激活的技術(shù)—EndoMTracer。αSMA是肌成纖維細(xì)胞的特征蛋白，也是指征間充質(zhì)細(xì)胞最常用的分子標(biāo)記之一（Tallquist et al., Nat Rev Cardiol 2017），因此研究人員首先檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中是否會(huì)激活表達(dá)αSMA。當(dāng)對(duì)小鼠用他莫昔芬誘導(dǎo)后，通過(guò)Cre-loxP重組，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)被特異地標(biāo)記上ZsGreen的熒光蛋白，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞中αSMA-LSL-Dre轉(zhuǎn)變成αSMA-Dre。在隨后的時(shí)間段內(nèi)，只要內(nèi)皮細(xì)胞短暫或瞬時(shí)的激活αSMA，那么就會(huì)表達(dá)出Dre重組酶，并發(fā)生Dre-rox重組，將該內(nèi)皮細(xì)胞永久的標(biāo)記上tdTomato的熒光蛋白。EndoMTracer系統(tǒng)一旦通過(guò)他莫昔芬誘導(dǎo)，后續(xù)就可以持續(xù)地記錄內(nèi)皮細(xì)胞中αSMA的激活，tdTomato陽(yáng)性代表著該內(nèi)皮細(xì)胞在檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)激活過(guò)αSMA。

　　研究人員首先利用EndoMTracer技術(shù)捕捉胚胎期心內(nèi)膜向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程。在母鼠懷孕8.5天后用他莫昔芬誘導(dǎo)EndoMTracer系統(tǒng)開(kāi)啟，并收集17.5天的胚胎心臟樣本進(jìn)行分析。研究人員在瓣膜處檢測(cè)到tdTomato陽(yáng)性的間充質(zhì)細(xì)胞，但不表達(dá)αSMA，說(shuō)明這些被標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞曾經(jīng)表達(dá)過(guò)αSMA，發(fā)生EndoMT，并被EndoMTracer技術(shù)永久地記錄下來(lái)。

　　接下來(lái)，研究人員利用EndoMTracer技術(shù)捕捉成體心臟纖維化中EndoMT過(guò)程。對(duì)成體小鼠用他莫昔芬誘導(dǎo)后，研究人員采用了不同的損傷模型來(lái)誘導(dǎo)心臟纖維化過(guò)程：主動(dòng)脈縮窄術(shù)和心肌梗死。在這兩種心臟損傷模型的不同時(shí)間點(diǎn)，均未檢測(cè)到tdTomato陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，說(shuō)明成體心臟內(nèi)皮細(xì)胞在纖維化過(guò)程中，不會(huì)瞬時(shí)激活間充質(zhì)細(xì)胞的特征基因αSMA，繼續(xù)保持著內(nèi)皮的特征。

　　機(jī)體損傷后，成纖維細(xì)胞被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，表達(dá)αSMA，促進(jìn)損傷區(qū)域的纖維化。研究人員利用相同的策略捕捉成纖維細(xì)胞中αSMA的激活表達(dá)。在小鼠心臟損傷后，研究人員檢測(cè)到在纖維化明顯的區(qū)域出現(xiàn)大量tdTomato陽(yáng)性的細(xì)胞，這些成纖維細(xì)胞同時(shí)表達(dá)αSMA。在損傷后期，成纖維細(xì)胞不再表達(dá)αSMA，但仍然標(biāo)記為tdTomato陽(yáng)性，表明成纖維細(xì)胞中短暫表達(dá)的間充質(zhì)基因αSMA被EndoMTracer永久地記錄下來(lái)。

　　研究人員接著采用了另一個(gè)間充質(zhì)的特征基因Zeb1，捕捉心臟內(nèi)皮中Zeb1的激活表達(dá)。胚胎期心內(nèi)膜EndoMT中表達(dá)過(guò)Zeb1的內(nèi)皮細(xì)胞被EndoMTracer永久地標(biāo)記為tdTomato陽(yáng)性。但是，成體心臟損傷纖維化后，研究人員沒(méi)有檢測(cè)到明顯的tdTomato信號(hào)，說(shuō)明心臟纖維化過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞不會(huì)瞬時(shí)激活Zeb1的表達(dá)。而部分成纖維細(xì)胞能短暫表達(dá)Zeb1，在心臟纖維化過(guò)程中被EndoMTracer永久記錄下來(lái)。

　　綜上，該工作建立了無(wú)縫隙捕捉特定基因轉(zhuǎn)錄激活的技術(shù)，揭示了在早期胚胎心臟發(fā)育中內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程，但成體心臟纖維化中內(nèi)皮細(xì)胞不會(huì)發(fā)生瞬時(shí)EndoMT，也不會(huì)形成肌成纖維細(xì)胞。心臟中的成纖維細(xì)胞在損傷過(guò)程中會(huì)被激活，表達(dá)間充質(zhì)基因，并促進(jìn)損傷區(qū)纖維化，提示心臟纖維化的治療靶點(diǎn)應(yīng)集中在成纖維細(xì)胞。

　　分子細(xì)胞卓越中心博士研究生張少華為該論文的第一作者，分子細(xì)胞卓越中心周斌研究員、上海交通大學(xué)新華醫(yī)院孫錕教授以及香港中文大學(xué)呂愛(ài)蘭教授為該論文共同通訊作者。該工作得到了英國(guó)阿斯利康Qing-dong Wang教授，上海交通大學(xué)陳豐原教授的大力支持。感謝分子細(xì)胞卓越中心動(dòng)物平臺(tái)和細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)對(duì)本研究的大力支持，感謝中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門(mén)的經(jīng)費(fèi)支持。

　　文章鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.121.055417

　　圖：研究人員利用EndoMTracer技術(shù)揭示了胚胎期心內(nèi)膜向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程存在EndoMT，但成體心臟損傷后內(nèi)皮細(xì)胞不會(huì)發(fā)生EndoMT, 成纖維細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)變形成了損傷區(qū)的大量肌成纖維細(xì)胞，會(huì)瞬時(shí)表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的基因，促進(jìn)心臟纖維化及病理重塑。