10月15日，中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究員在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Trends in Cell Biology發(fā)表了題為“Harnessing orthogonal recombinases to decipher cell fate with enhanced precision”的綜述文章。該文章系統(tǒng)地回顧了正交雙同源重組酶系統(tǒng)遺傳學(xué)操作的發(fā)展歷程，深入討論了雙同源重組酶系統(tǒng)在各個(gè)器官與系統(tǒng)中的應(yīng)用如何彌補(bǔ)了單同源重組酶系統(tǒng)的局限進(jìn)而厘清了各領(lǐng)域內(nèi)的爭(zhēng)議問(wèn)題，并且展望了正交同源重組酶系統(tǒng)未來(lái)的發(fā)展方向和新的研究思路。

　　Cre-loxP同源重組系統(tǒng)是在多種模式生物，尤其是小鼠中，廣泛應(yīng)用的遺傳學(xué)操作系統(tǒng)。Cre重組酶能夠識(shí)別loxP DNA序列并進(jìn)行DNA序列插入、刪除和反轉(zhuǎn)操作。Cre-loxP系統(tǒng)常用于基因的條件型敲除或者重組刪除STOP cassette來(lái)啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因，例如報(bào)告基因的表達(dá)。盡管其已經(jīng)發(fā)展成為組織特異性與可誘導(dǎo)型的系統(tǒng)，Cre-loxP系統(tǒng)依然存在一些局限性并且導(dǎo)致了一些研究中實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤讀。與此同時(shí)，多種特異位點(diǎn)重組酶系統(tǒng)，例如Flp-frt、Dre-rox等在噬菌體等生物中被發(fā)現(xiàn)。在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域中，Susan Dymecki等最早聯(lián)用Cre和Flp兩種特異位點(diǎn)重組酶來(lái)精確示蹤，發(fā)現(xiàn)了中央神經(jīng)系統(tǒng)中脈絡(luò)叢和頂板結(jié)構(gòu)的發(fā)育來(lái)源。由此開(kāi)始，雙同源重組系統(tǒng)被逐步應(yīng)用到多個(gè)研究領(lǐng)域中。該綜述以c-Kit⁺心肌干細(xì)胞的為例，聚焦于單重組酶系統(tǒng)依賴于單個(gè)基因調(diào)控元件的低特異性問(wèn)題。c-Kit陽(yáng)性的干細(xì)胞曾經(jīng)被報(bào)道為內(nèi)源性成體心臟干細(xì)胞，能夠分化為包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，為心血管疾病的治療帶來(lái)了希望。然而，三個(gè)研究組分別使用基于c-Kit的譜系示蹤工具并沒(méi)能發(fā)現(xiàn)成年小鼠中c-Kit細(xì)胞的成心肌能力。為了厘清這一問(wèn)題，周斌研究課題組利用Cre和Dre兩種重組酶激活的雙同源重組系統(tǒng)（DeaLT）來(lái)排除傳統(tǒng)譜系示蹤技術(shù)示蹤c-Kit成體干細(xì)胞時(shí)對(duì)于心肌細(xì)胞的異位標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了心肌細(xì)胞和cKit⁺非心肌細(xì)胞同時(shí)不可逆標(biāo)記，從而精確地得出c-Kit陽(yáng)性成體哺乳動(dòng)物非心肌細(xì)胞在生理或病理情況下均不能發(fā)生向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變的結(jié)論。DeaLT后續(xù)同樣被用于探尋所有非心肌細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，成體肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可塑性，新生beta細(xì)胞的來(lái)源等各種需要同時(shí)精準(zhǔn)示蹤多種細(xì)胞類型的問(wèn)題。

　　隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)發(fā)展，同一細(xì)胞類型內(nèi)的異質(zhì)性被越來(lái)越清晰地認(rèn)知。雙同源重組系統(tǒng)的選擇性標(biāo)記能力也使得研究者能夠使用兩個(gè)標(biāo)記基因以不同的遺傳學(xué)構(gòu)造靶向它們的交集、補(bǔ)集或同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)亞群的標(biāo)記。通過(guò)構(gòu)造新的基于Cre和Dre雙同源重組酶的遺傳學(xué)策略，周斌研究課題組實(shí)現(xiàn)了對(duì)于Sca1⁺細(xì)胞中的Sca1與PDGFRa或PDGFRb兩群雙陽(yáng)性細(xì)胞的譜系示蹤，確認(rèn)了Sca1⁺ 細(xì)胞在動(dòng)脈平滑肌修復(fù)中的作用，并且揭示了Sca1⁺細(xì)胞亞群中各異的平滑肌修復(fù)能力。類似方法也被用于脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞和氣管肺泡干細(xì)胞等細(xì)胞群的命運(yùn)分析，以及神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)異質(zhì)性和神經(jīng)環(huán)路的標(biāo)記。PDGFRa與PDGFRb雙陽(yáng)性與單陽(yáng)性亞群只有使用雙同源重組系統(tǒng)才能夠進(jìn)行同時(shí)地標(biāo)記并平行分析，從而直接就三種細(xì)胞亞群對(duì)于新生脂肪細(xì)胞的貢獻(xiàn)進(jìn)行比較。傳統(tǒng)方法也無(wú)法特異標(biāo)記同時(shí)表達(dá)Club和AT2細(xì)胞標(biāo)記基因CC10和SPC的氣管-肺泡干細(xì)胞（BASCs），而研究人員通過(guò)雙同源重組系統(tǒng)和Split-Cre系統(tǒng)分別獨(dú)立對(duì)BASCs進(jìn)行譜系示蹤并就其對(duì)于肺損傷的修復(fù)貢獻(xiàn)進(jìn)行了探究。Josh Huang等則通過(guò)聯(lián)用腦區(qū)域病毒注射、Cre與Flp雙同源重組系統(tǒng)和Tet-On系統(tǒng)等，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)神經(jīng)連接、腦區(qū)位置、基因表達(dá)譜、發(fā)育時(shí)期和來(lái)源等多種維度的亞群標(biāo)記GABA能神經(jīng)元，對(duì)于揭示其各異的功能具有重大意義。

　　為了更好地研究目標(biāo)細(xì)胞的生理功能與機(jī)制，特定細(xì)胞亞群的基因敲除或者細(xì)胞清除也可以通過(guò)雙同源重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，彌補(bǔ)了廣泛基因敲除或細(xì)胞清除不特異在研究細(xì)胞亞群功能中的缺陷。周斌研究課題組通過(guò)Plin1-dCreER策略實(shí)現(xiàn)了靶向無(wú)特異標(biāo)記基因的白色脂肪細(xì)胞亞群（WAT）的Cre活性，從而實(shí)現(xiàn)在WAT中轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的編碼基因的敲除。此外，Wt1-CrexER通過(guò)Dre重組膜定位雌激素受體（ER）序列而將誘導(dǎo)型CreER轉(zhuǎn)化為持續(xù)性的Cre，從而在心臟中特異性敲除內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGFR2，造成了心臟血管生成障礙。而另一研究通過(guò)Flp激活的Cre進(jìn)行Rbpj敲除也抑制了動(dòng)脈的分化，細(xì)致地探究了血管生成和分化過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制。以上系統(tǒng)最終的效應(yīng)重組酶都是Cre，因此可以兼容以往為Cre設(shè)計(jì)的多種細(xì)胞探針或者報(bào)告基因。在細(xì)胞層面上，雙同源重組系統(tǒng)在脊髓背側(cè)興奮性或抑制性神經(jīng)元中啟動(dòng)白喉毒素受體（DTR）表達(dá)來(lái)介導(dǎo)特定神經(jīng)元的清除，直觀地展示了這兩種神經(jīng)元在痛覺(jué)感受神經(jīng)回路中的不同作用，完善了對(duì)于痛覺(jué)感受通路的了解。胰島beta細(xì)胞特異的DTR表達(dá)和細(xì)胞清除也使得少數(shù)非beta細(xì)胞群分泌多種激素的可塑性得到揭示。

　　除了利用雙同源重組系統(tǒng)高效而精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞亞群中的基因敲除與細(xì)胞清除，多種雙同源重組系統(tǒng)構(gòu)造策略也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)于短暫性細(xì)胞狀態(tài)的無(wú)縫隙捕捉。Lgals-rox-STOP-rox-Cre的STOP在平滑肌細(xì)胞中被Dre重組，從而在Lgals3表達(dá)時(shí)啟動(dòng)Cre。即使這一基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)移完成后不再表達(dá)，也能實(shí)現(xiàn)所有Lgals3⁺平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記。揭示了平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化損傷修復(fù)中短暫表達(dá)Lgals3并首先移動(dòng)到損傷處的過(guò)程。類似地，Kit-CreER通過(guò)切割Vimentin-LSL-Dre和N-Cadherin-LSL-Dre的STOP cassette，使得Dre可以在luminal細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)表達(dá)，幫助揭示這些基因在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)的作用和分子機(jī)制。研究生理環(huán)境下的短暫的細(xì)胞狀態(tài)差異例如細(xì)胞周期的改變同樣是非常重要的，而在肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或神經(jīng)元中細(xì)胞周期活動(dòng)都比較稀少和復(fù)雜。用傳統(tǒng)的核酸類似物摻入或者免疫熒光染色檢測(cè)這些細(xì)胞的增殖都會(huì)有信噪比低、可追蹤時(shí)間不長(zhǎng)等問(wèn)題，并會(huì)受到增殖更旺盛的巨噬或內(nèi)皮等細(xì)胞的干擾。而基于單分子的長(zhǎng)期譜系示蹤則局限于某些細(xì)胞亞群，不同的研究人員曾經(jīng)提出Axin2⁺中央靜脈周圍肝細(xì)胞、Sox9⁺門(mén)靜脈周圍肝細(xì)胞理論或分散的Terthigh肝細(xì)胞具有增殖優(yōu)勢(shì)。但是，利用Ki67-CrexER，周斌研究課題組實(shí)現(xiàn)了所有細(xì)胞類型或者肝細(xì)胞特異的增殖信息長(zhǎng)時(shí)程、不間斷的記錄。而基于Ki67-CrexER的ProTracer可以看到Zone 2的肝細(xì)胞熒光標(biāo)記數(shù)量尤其高，指征這一區(qū)域的增殖優(yōu)勢(shì)。

　　該綜述總結(jié)了多種類型的位點(diǎn)特異性重組酶及其遺傳學(xué)操作特點(diǎn)，還總結(jié)了各種正交同源重組系統(tǒng)的設(shè)計(jì)思路。盡管雙同源重組系統(tǒng)擁有揭示豐富的細(xì)胞和分子層面信息的能力，但其轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)造復(fù)雜程度較高，并且受到位點(diǎn)特異型重組酶本身特性的掣肘，在實(shí)際應(yīng)用中依然存在一些問(wèn)題。該綜述總結(jié)了重組酶非特異活性及雙同源重組系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)造繁瑣等缺點(diǎn)，并提示了未來(lái)突破以上問(wèn)題和提高正交同源重組酶在各種細(xì)胞類型或狀態(tài)的準(zhǔn)確標(biāo)記和遺傳學(xué)操作能力的研究方向。此外，本文也展望了未來(lái)正交同源重組系統(tǒng)用于細(xì)胞間接觸或是各種細(xì)胞程序性死亡后標(biāo)記的研究方向。

　　中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組博士研究生翁文棟和劉秀秀為本文的共同第一作者，周斌研究員為本文的通訊作者。該項(xiàng)工作得到了香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Kathy O. Lui教授的大力支持，以及來(lái)自中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門(mén)的經(jīng)費(fèi)支持。

　　文章鏈接：https://www.cell.com/trends/cell-biology/fulltext/S0962-8924(21)00186-0 

利用雙同源重組酶實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程不間斷記錄細(xì)胞事件