北京時間2月26日，國際學術(shù)期刊Science以Research Article形式在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌研究組的研究成果“Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair”。該研究首次開發(fā)了能夠長時程示蹤體內(nèi)細胞增殖的新技術(shù)，利用該技術(shù)研究人員發(fā)現(xiàn)了成體肝細胞的來源，為肝臟再生及疾病臨床治療研究提供了新思路。
細胞增殖是多細胞生物體在發(fā)育、生理穩(wěn)態(tài)和組織再生中的基本生物學過程，細胞增殖過多或者受阻是許多疾病的致病基礎(chǔ)。檢測細胞的增殖能力對于發(fā)育生物學、腫瘤學、神經(jīng)科學和再生醫(yī)學等眾多學科的研究至關(guān)重要。目前檢測細胞增殖的方法主要有兩種：（1）基于細胞增殖標記物（如Ki67、pH-H3等）的組織化學染色；（2）核苷酸類似物（如BrdU、EdU等）的摻入。不過，上述檢測方法都存在著一定的局限性：在時間上，檢測的是某個時間點而非某個時間段內(nèi)的細胞增殖，就像照相機，只能拍攝某一瞬間的細胞增殖信號，這對于一些增殖能力較低的細胞如心肌細胞、神經(jīng)元等很難檢測到；在空間上，所有類型的增殖細胞都會被無差別的檢測，容易造成非目的細胞增殖信號的干擾，信噪比低、分辨率差。因此，開發(fā)一種有效檢測體內(nèi)細胞增殖的新技術(shù)，實現(xiàn)長時間不間斷、組織特異性地標記細胞增殖尤為重要。
周斌研究組長期致力于新型遺傳譜系示蹤技術(shù)的開發(fā)與應用，在該項研究中，他們建立了一種檢測細胞增殖的新技術(shù)—ProTracer（Proliferation Tracer）。作為一種遺傳學技術(shù)，ProTracer突破了傳統(tǒng)檢測細胞增殖方法的思維模式，利用廣泛使用的細胞增殖標記物Ki67, 在基于課題組前期開發(fā)的Dre-rox和Cre-loxP的雙同源重組酶介導的遺傳譜系示蹤技術(shù)（He et al., Nature Medicine 2017）基礎(chǔ)上，利用Dre-rox啟動Cre同源重酶介導的細胞增殖示蹤系統(tǒng)進行遺傳標記。ProTracer猶如一臺錄像機，一旦啟動，可以實現(xiàn)在數(shù)月甚至數(shù)年內(nèi)不間斷地記錄細胞增殖，這對于檢測增殖能力較低的細胞以及評估細胞增殖能力的動態(tài)變化過程極其有益。并且，ProTracer可以實現(xiàn)直接檢測某一特定譜系細胞增殖情況，避免其他類型細胞增殖信號的干擾，提高了信噪比和分辨率，使檢測信號更直觀，能夠?qū)崿F(xiàn)從器官整體水平上觀察細胞增殖。此外，ProTracer能夠?qū)崿F(xiàn)活體檢測細胞增殖，可以在不犧牲動物的情況下，直接在同一個動物上多時間點檢測體內(nèi)細胞增殖，觀察細胞增殖的動態(tài)變化過程。ProTracer可以廣泛地應用于不同組織器官細胞增殖的檢測，為發(fā)育生物學、腫瘤學、神經(jīng)科學和再生醫(yī)學等眾多領(lǐng)域的研究提供強大的技術(shù)支撐。
周斌研究組利用ProTracer研究了在成體肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過程中肝細胞的來源。目前，在肝臟領(lǐng)域，這是一個亟待解決且具有爭議的重要科學問題。盡管在某些極其嚴重的肝損傷情況下，膽管細胞可以轉(zhuǎn)分化貢獻形成肝細胞，但是在肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過程中的肝細胞的更新主要依賴原有肝細胞的自我增殖。肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位是肝小葉，肝小葉中的肝細胞由于代謝功能和基因表達等的不同具有較大的異質(zhì)性，從肝門靜脈區(qū)到肝中央靜脈區(qū)大體可分為三區(qū)：門靜脈周圍肝細胞（E-CAD+，Zone 1）、中間區(qū)肝細胞（E-CAD–GS–，Zone 2）和中央靜脈周圍肝細胞（GS+，Zone 3）。 有研究認為不同區(qū)域的肝細胞增殖能力顯著不同, 但究竟哪些肝細胞亞群對新生肝細胞起主要貢獻仍存在較大爭議，目前主要有以下幾種理論：（1）肝細胞流動理論（肝細胞由門靜脈側(cè)向中央靜脈側(cè)流動，Liver 1985）；（2）中央靜脈周圍肝細胞理論（Axin2+肝細胞，Nature 2015）；（3）門靜脈周圍肝細胞理論（Sox9+肝細胞，Cell 2015）；（4）分散式理論（Terthigh肝細胞，Nature 2018）；（5）廣泛分布式理論（肝細胞無差別增殖，Cell Stem Cell 2020）。以往的這些研究均是依賴單個分子標記分析肝臟中某一肝細胞亞群的擴增能力，缺少對肝臟整體水平上對所有肝細胞增殖能力的分析，猶如盲人摸象，觀察的是事物的局部而非整體，因此很難做出一個全面準確的判斷。
周斌研究組突破以往的研究模式，即不再依賴單一分子標記追蹤某一肝細胞亞群的擴增情況，而是利用ProTracer技術(shù)去直接標記新生的肝細胞，不僅可以實現(xiàn)對所有肝細胞類群進行分析，還可以直觀精準地展現(xiàn)出新生肝細胞的來源。研究人員首先采用廣譜性的ProTracer（所有類型細胞的增殖都能夠被檢測）在成體啟動細胞增殖的記錄，并在啟動后的多個不同時間點檢測肝細胞的增殖信號，結(jié)合E-CAD和GS等肝細胞分區(qū)標記基因免疫熒光共染色，發(fā)現(xiàn)在生理穩(wěn)態(tài)過程中肝細胞通過緩慢的增殖維持自我更新。意外的是，新生的肝細胞并非來源于以往報道的任何一個類群，而是主要來源于肝小葉中的中間區(qū)域（E-CAD–GS–，Zone 2）。
為了排除非肝細胞增殖信號的干擾，研究人員在廣譜性ProTracer技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合肝細胞特異性表達的基因Albumin（Alb）啟動子，開發(fā)了肝細胞特異性的ProTracer技術(shù)。肝細胞特異性的ProTracer僅標記肝細胞的增殖，能夠?qū)崿F(xiàn)直接在肝臟器官整體水平上展現(xiàn)肝細胞增殖。
將肝細胞特異性ProTracer在成體啟動后，研究人員將肝臟的全標本進行了熒光拍照，發(fā)現(xiàn)被tdTomato紅色熒光標記的增殖的肝細胞呈現(xiàn)出一圈圈類似“甜甜圈”的形狀（圖A），說明肝細胞增殖具有區(qū)域偏好性，肝臟組織切片的免疫熒光染色結(jié)果進一步證實了增殖的肝細胞位于肝小葉的中間區(qū)域，即E-CAD–GS–的Zone 2（圖B）。此外，周斌組還開發(fā)了活體檢測肝細胞增殖的ProTracer技術(shù)，利用該技術(shù)他們檢測了同一個小鼠個體在多個不同時間點肝細胞的增殖及其動態(tài)變化過程，這也是世界上首次實現(xiàn)活體檢測細胞增殖。
為了研究肝臟損傷再生過程中新生肝細胞的來源，研究人員利用ProTracer技術(shù)結(jié)合肝切、膽管結(jié)扎和CCl4等多種肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)在肝切模型中，位于Zone 1的肝細胞起始肝臟再生過程，然后Zone 2 的肝細胞迅速增殖。而在膽管結(jié)扎和CCl4急性損傷模型中，則是位于Zone 2的肝細胞起始肝臟再生過程。此外，研究人員利用廣譜性ProTracer系統(tǒng)地描繪了肝臟再生過程中其他類型細胞的增殖情況，如膽管上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞。
綜上，該研究的亮點在于開發(fā)了一種檢測細胞增殖的遺傳新技術(shù)——ProTracer，以全新的視角研究了成體肝細胞的來源，突破了傳統(tǒng)思維模式和技術(shù)局限性，直觀地展現(xiàn)了所有肝細胞類群的增殖情況，首次發(fā)現(xiàn)肝小葉中間區(qū)域（Zone 2）的肝細胞是成體肝臟在生理穩(wěn)態(tài)中新生肝細胞的主要細胞來源，同時揭示了不同損傷再生模型中新生肝細胞的來源，準確回答了成體肝細胞來源這一重要科學問題。該研究為肝臟損傷修復再生研究開辟了新思路，為肝臟疾病的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。
此外，新開發(fā)的ProTracer技術(shù)具有長時間不間斷檢測細胞增殖的能力，可以特異性地標記某種特定細胞譜系的細胞增殖，并且實現(xiàn)了不犧牲樣品直接活體檢測細胞增殖，從多個維度刷新了細胞增殖檢測的能力和范圍，可以廣泛應用于不同組織器官細胞增殖的檢測，為發(fā)育生物學、腫瘤學、神經(jīng)科學和再生醫(yī)學等眾多領(lǐng)域的研究提供強大技術(shù)支撐。
中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌研究組副研究員何靈娟博士（現(xiàn)就職于西湖大學）、博士后蒲文娟、博士研究生劉秀秀為該論文的共同第一作者，周斌研究員為該論文通訊作者。該工作得到了瑞士諾華醫(yī)學生物研究所的Jan S. Tchorz教授、南京醫(yī)科大學季勇教授、瑞典阿斯利康 Qing-Dong Wang博士和上海南方模式生物公司的孫瑞林博士及其團隊的大力支持。該工作也得到分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心動物平臺和細胞分析技術(shù)平臺的大力支持，并得到來自中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經(jīng)費支持。
圖：（A）利用肝細胞特異性的ProTracer標記增殖肝細胞的成體小鼠肝臟。tdTomato+的增殖肝細胞呈現(xiàn)出一圈圈的類似“甜甜圈”的形狀。（B）利用ProTracer揭示成體肝臟中新生肝細胞（tdTomato+）主要來源于E-CAD–GS– Zone 2。E-CAD（綠色）；GS（青色）。
