中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）陳玲玲研究組合作首次建立了特異敲低環(huán)形RNA的CRISPR-RfxCas13d/BSJ-gRNA系統(tǒng)，并用其開展環(huán)形RNA的功能篩選研究，發(fā)現(xiàn)了一系列影響細(xì)胞增殖和參與小鼠胚胎植入前發(fā)育的環(huán)形RNA分子。相關(guān)研究（Screening for functional circular RNAs using the CRISPR-Cas13 system）于12月7日在線發(fā)表在國際權(quán)威期刊Nature Methods上。
外顯子反向剪接形成的環(huán)形RNA是一類不具有5' 帽子和3' 尾巴的共價(jià)閉合RNA分子。轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析揭示了多達(dá)幾十萬個(gè)環(huán)形RNA在不同物種和細(xì)胞中差異表達(dá)。由于環(huán)形RNA與其對應(yīng)的線形RNA在一級序列上完全重復(fù)，如何有效區(qū)分環(huán)形RNA及其對應(yīng)的線形RNA分子，是限制環(huán)形RNA功能研究的瓶頸，也是領(lǐng)域有待突破的前沿?zé)狳c(diǎn)和難點(diǎn)。繼研究組在2019年首次揭示環(huán)形RNA作為一個(gè)整體，通過其不同于線形RNA的二級結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞天然免疫調(diào)控的新功能后（Liu et al., Cell, 2019），在這項(xiàng)最新的研究中，科研人員篩選、構(gòu)建并優(yōu)化了可特異敲低環(huán)形RNA的高效CRISPR-RfxCas13d/BSJ-gRNA系統(tǒng)，理論上可以針對任意環(huán)形RNA個(gè)體開展功能篩選，為研究相關(guān)環(huán)形RNA的功能提供了新的研究手段和思路。
相較于傳統(tǒng)的RNA干擾方法（包括shRNA和siRNA），CRISPR-RfxCas13d/BSJ-gRNA系統(tǒng)能夠高效地敲低環(huán)形RNA表達(dá)而不影響其親本線形mRNA表達(dá)，呈現(xiàn)出了更好的環(huán)形RNA敲除效果和靶向效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，科研人員成功構(gòu)建并利用兩個(gè)RfxCas13d/BSJ-gRNA文庫針對一系列人源細(xì)胞系中高表達(dá)的環(huán)形RNA開展功能靶向篩選。利用建立的體內(nèi)和體外細(xì)胞增殖篩選體系及全新的高通量CRISPR-Cas13環(huán)形RNA功能篩選計(jì)算分析流程CDCscreen （Cas13d-mediated circRNA screen， https://github.com/YangLab/CDCscreen），捕獲與細(xì)胞增殖相關(guān)的多個(gè)環(huán)形RNA功能分子，并進(jìn)一步揭示這些功能環(huán)形RNA大都具有細(xì)胞類型依賴的細(xì)胞增殖調(diào)控作用。在針對一個(gè)具有廣譜細(xì)胞增殖調(diào)控作用的環(huán)形RNA（circFAM120A）開展深入的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，其主要通過干擾翻譯抑制因子IGF2BP2與親本FAM120A mRNA的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)了FAM120A的蛋白翻譯及細(xì)胞的增殖。最后，科研人員還將CRISPR-RfxCas13d/BSJ-gRNA體系運(yùn)用于小鼠早期胚胎發(fā)育研究，篩選并鑒定首個(gè)參與小鼠胚胎植入前發(fā)育的環(huán)形RNA，首次證明了環(huán)形RNA參與小鼠早期胚胎發(fā)育的潛能。綜上，這一CRISPR-RfxCas13d/BSJ-gRNA體系的建立及其在環(huán)形RNA功能研究中的應(yīng)用，為全面和深入理解環(huán)形RNA的生物學(xué)功能提供了新的技術(shù)體系和研究范式。
該研究工作主要由分子細(xì)胞卓越中心陳玲玲組李斯琪博士、李響博士、中科院上海營養(yǎng)與健康研究所（中科院-馬普學(xué)會計(jì)算生物學(xué)伙伴研究所）楊力組薛尉博士生和分子細(xì)胞卓越中心李勁松組張麟博士生共同完成，陳玲玲研究員、楊力研究員和李勁松研究員為該論文的共同通訊作者。
a，CRISPR-Cas13系統(tǒng)靶向環(huán)形RNA示意圖；b，比較Cas13a、Cas13b和Cas13d對環(huán)形RNA的敲降效果。
