1月8日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Cell Research在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）楊薈研究組題為“Structural basis of a Tn7-like transposase recruitment and DNA loading to CRISPR-Cas surveillance complex“的研究成果。該研究闡明了霍亂弧菌I-F 亞型Cascade效應(yīng)復(fù)合物招募Tn7樣轉(zhuǎn)座子亞基TniQ的分子機(jī)制，及Cascade-TniQ復(fù)合物對(duì)DNA的序列特異性識(shí)別過(guò)程，對(duì)潛在新型基因編輯工具的開(kāi)發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。

 

        CRISPR系統(tǒng)是原核生物體內(nèi)由RNA介導(dǎo)的，序列特異性識(shí)別外源核酸，并通過(guò)核酸內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行切割的獲得性免疫系統(tǒng)。早先的研究發(fā)現(xiàn)幾種核酸內(nèi)切酶基因缺失的I-F、I-B和V-K亞型CRISPR系統(tǒng)與DNA靶向亞基缺失的Tn7樣轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化和功能上相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，這類(lèi)I-F和V-K亞型CRISPR系統(tǒng)可與轉(zhuǎn)座相關(guān)蛋白共同作用，在大腸桿菌細(xì)胞全基因組范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)RNA介導(dǎo)的DNA特異位點(diǎn)插入。在霍亂弧菌中，轉(zhuǎn)座蛋白TniQ可與I-F 亞型Cascade效應(yīng)復(fù)合物直接作用，并在DNA插入過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用。CRISPR系統(tǒng)與Tn7樣轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA插入不依賴CRISPR系統(tǒng)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而不依賴細(xì)胞內(nèi)源DNA修復(fù)途徑，為基因編輯提供一種全新的模式。然而，這一過(guò)程的分子機(jī)制并不清楚。

 

        在本項(xiàng)研究中，研究人員利用X-射線晶體衍射技術(shù)和單顆粒冷凍電鏡技術(shù)分別解析了apo-TniQ的晶體結(jié)構(gòu)和Cascade-TniQ復(fù)合物與DNA結(jié)合前后的電鏡結(jié)構(gòu)?；魜y弧菌的Cascade復(fù)合物由Cas6、Cas7、Cas8（Cas5和Cas8基因融合蛋白）和crRNA以1:6:1:1的比例組裝而成，整體結(jié)構(gòu)與已報(bào)道I-F亞型其他Cascade復(fù)合物較為相似。Cas6位于復(fù)合物頭部并結(jié)合crRNA的3’莖環(huán)部分，Cas8位于復(fù)合物尾部并結(jié)合crRNA的5’端，6個(gè)Cas7形成復(fù)合我的的骨架并結(jié)合crRNA的間隔區(qū)（spacer）。底物DNA結(jié)合后，Cas8通過(guò)DNA雙鏈小溝序列特異性識(shí)別PAM序列，并穩(wěn)定被打開(kāi)的DNA雙鏈。目標(biāo)DNA鏈與crRNA的間隔區(qū)互補(bǔ)配對(duì)形成DNA-RNA雜交鏈，由6個(gè)Cas7穩(wěn)定。TniQ形成同源二聚體結(jié)合在Cascade復(fù)合物頭部，分別與Cas6和Cas7.1相互作用。DNA結(jié)合后，Cascade-TniQ復(fù)合物發(fā)生微小變化，crRNA螺旋軸增長(zhǎng)，復(fù)合物整體構(gòu)象更為伸展。本項(xiàng)工作的研究成果闡明了轉(zhuǎn)座蛋白TniQ與Cascade復(fù)合物的組裝機(jī)制以及Cascade-TniQ復(fù)合物識(shí)別DNA的分子機(jī)制，深入理解RNA介導(dǎo)的DNA位點(diǎn)特異性插入的起始過(guò)程，為新型基因編輯方式的開(kāi)發(fā)提供結(jié)構(gòu)信息。

 

        楊薈研究員為本文通訊作者，碩士研究生王蓓蓓為第一作者。感謝張江實(shí)驗(yàn)室國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究設(shè)施（上海）冷凍電鏡系統(tǒng)、18U、19U1線站以及上海同步輻射光源17U線站的工作人員在數(shù)據(jù)收集時(shí)提供的支持和幫助。該研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委項(xiàng)目的經(jīng)費(fèi)支持。

 

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