11月26日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Journal of Biological Chemistry在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組的科研成果“Triple-cell lineage tracing by a dual reporter on a single allele”。該研究基于Dre-rox和Cre-loxP雙同源重組系統(tǒng)，構(gòu)建了一種新的雙同源重組報(bào)告系統(tǒng)，可以達(dá)到在體內(nèi)同時(shí)標(biāo)記示蹤三種細(xì)胞群。這一研究為新型雙同源重組報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建提供了新的思路，進(jìn)一步擴(kuò)充了雙同源重組報(bào)告系統(tǒng)庫(kù)，并為發(fā)育、疾病和再生研究提供了新的技術(shù)選擇。

 

        基于基因位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)的遺傳譜系示蹤技術(shù)被廣泛應(yīng)用于器官發(fā)育、組織再生和疾病研究。目前，多種重組酶系統(tǒng)被普遍使用，例如Cre-loxP、Flpe-frt和Dre-rox系統(tǒng)。其中使用最普遍的為Cre-loxP系統(tǒng)。Cre重組酶受組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，當(dāng)Cre識(shí)別兩個(gè)同向loxP位點(diǎn)之后，會(huì)誘導(dǎo)Cre-loxP重組，并將兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的轉(zhuǎn)錄終止序列切除，從而使轉(zhuǎn)錄終止序列之后的報(bào)告基因表達(dá)。由于這種切除事件發(fā)生在基因水平上，具有永久性和不可逆性，因此表達(dá)Cre的細(xì)胞群及其子代細(xì)胞（無(wú)論是否還在表達(dá)Cre）都將永久性地被報(bào)告基因蛋白所標(biāo)記。

 

        目前，已經(jīng)有多種雙同源重組報(bào)告系統(tǒng)被構(gòu)建，可多方式地對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行更精確的譜系示蹤研究。 例如R26::FLAP，RC::Fela，R26NZG，RC::RLTG，IR1，NR1，R26-TLR等，可在體內(nèi)同時(shí)標(biāo)記更精確的兩種細(xì)胞群。在以往的雙同源重組系統(tǒng)中，由于兩種重組酶識(shí)別位點(diǎn)的排列方式是相間排列或嵌套排列, 其兩種報(bào)告基因的表達(dá)會(huì)彼此影響，無(wú)法各自獨(dú)立表達(dá)。而且它們無(wú)法在體內(nèi)同時(shí)標(biāo)記更多的細(xì)胞群。在器官發(fā)育或組織再生中，一種細(xì)胞可能有多種發(fā)育起源，例如在心臟發(fā)育中，其成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、周細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞起源于心臟心內(nèi)膜細(xì)胞和心外膜細(xì)胞。同時(shí)，一種干細(xì)胞可能會(huì)分化為多種細(xì)胞類型，例如小腸隱窩Lgr5⁺干細(xì)胞能分化為潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞等各種小腸特化細(xì)胞。因此，構(gòu)建一種新的具有在體內(nèi)同時(shí)對(duì)多種細(xì)胞群進(jìn)行標(biāo)記能力的雙同源重組系統(tǒng)將對(duì)發(fā)育和再生生物學(xué)研究具有重要意義。

 

        為了解決這一問(wèn)題，研究人員基于Dre-rox和Cre-loxP同源重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建了一種新的雙同源重組報(bào)告系統(tǒng)，稱為 R26-TLR（Rosa26-traffic light reporter）。R26-TLR的具體結(jié)構(gòu)為Rosa26-CAG-rox-Stop-rox-Zsgreen-insulator-CAG-loxP-Stop-loxP-tdTomato。當(dāng)發(fā)生Dre-rox重組后，ZsGreen基因會(huì)表達(dá)，而發(fā)生Cre-loxP重組后tdTomato基因會(huì)表達(dá)。ZsGreen和tdTomato的表達(dá)能夠受獨(dú)立的重組事件調(diào)控而不會(huì)相互影響。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Dre和Cre重組酶時(shí)，這個(gè)細(xì)胞會(huì)同時(shí)發(fā)生Dre-rox和Cre-loxP重組而同時(shí)表達(dá)ZsGreen和tdTomato。所以這個(gè)系統(tǒng)可對(duì)三種細(xì)胞群進(jìn)行同時(shí)標(biāo)記示蹤。研究人員進(jìn)一步利用Sftpc-DreER;Scgb1a1-CreER;R26-TLR三基因型小鼠進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。Sftpc是肺臟II型肺泡上皮細(xì)胞（AT2 cell）的分子標(biāo)記，Scgb1a1是支氣管棒狀細(xì)胞（club cell）的分子標(biāo)記。Sftpc⁺Scgb1a1⁺雙陽(yáng)性支氣管肺泡干細(xì)胞（BASCs）位于支氣管和肺泡交界處（BADJs），是一群新發(fā)現(xiàn)的多潛能肺上皮干細(xì)胞。對(duì)以上三基因型小鼠進(jìn)行Tamoxifen誘導(dǎo)后，收取肺臟組織進(jìn)行免疫熒光分析，證實(shí)了R26-TLR特異性的在體內(nèi)同時(shí)將Sftpc⁺ II型肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)記成ZsGreen⁺tdTomato^–綠色熒光，將Scgb1a1⁺ 棒狀細(xì)胞標(biāo)記成tdTomato⁺ZsGreen^–紅色熒光，將Sftpc⁺Scgb1a1⁺ BASCs標(biāo)記成ZsGreen⁺tdTomato⁺黃色熒光。進(jìn)一步對(duì)肺臟進(jìn)行損傷，發(fā)現(xiàn)可同時(shí)示蹤這三種細(xì)胞群的在肺損傷修復(fù)中的不同響應(yīng)情況。發(fā)現(xiàn)在萘（Naphthalene）誘導(dǎo)的支氣管上皮損傷修復(fù)過(guò)程中，tdTomato⁺ZsGreen^– 示蹤的棒狀細(xì)胞主要負(fù)責(zé)再生遠(yuǎn)離支氣管末端的棒狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞，而ZsGreen⁺tdTomato⁺示蹤的BASCs負(fù)責(zé)再生支氣管末端的棒狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞。在博來(lái)霉素（Bleomycin）誘導(dǎo)的肺泡損傷后，ZsGreen⁺tdTomato^– 示蹤的II型肺泡上皮細(xì)胞負(fù)責(zé)修復(fù)再生遠(yuǎn)離BADJ的肺泡上皮，而ZsGreen⁺tdTomato⁺示蹤的BASCs負(fù)責(zé)再生BADJ附近區(qū)域的肺泡上皮?？偨Y(jié)來(lái)講，R26-TLR可在體內(nèi)同時(shí)標(biāo)記三種細(xì)胞群，為發(fā)育、疾病和再生研究提供了新的研究工具。

 

        該研究工作在周斌研究員的指導(dǎo)下，由研究生劉擴(kuò)等完成，并得到了季紅斌研究員的大力支持，同時(shí)得到中國(guó)科學(xué)院、國(guó)家基金委、國(guó)家科技部、上海市科委等經(jīng)費(fèi)資助。

 

 

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