7月2日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Plos Biology在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）李勁松研究組和鄒衛(wèi)國(guó)研究組合作完成的研究成果“Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development”。該研究應(yīng)用孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞（“人造精子細(xì)胞”）介導(dǎo)的半克隆技術(shù)結(jié)合CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯，成功實(shí)現(xiàn)了小鼠骨發(fā)育相關(guān)基因的個(gè)體水平遺傳篩選，并揭示Irx5作為骨發(fā)育過(guò)程中重要調(diào)控因子，通過(guò)抑制PPARγ促進(jìn)成骨分化并抑制成脂分化，為小鼠發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵基因功能研究開辟了新的途徑。

 

        CRISPR-Cas9技術(shù)介導(dǎo)的突變篩選在小鼠和人細(xì)胞中已被廣泛應(yīng)用，而實(shí)現(xiàn)高效的小鼠個(gè)體水平遺傳篩選對(duì)哺乳動(dòng)物功能基因組研究具有重要意義。此研究中，科研人員基于體外骨分化過(guò)程高通量測(cè)序分析數(shù)據(jù)篩選了72個(gè)潛在骨發(fā)育相關(guān)基因，建立了一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)Cas9同時(shí)攜帶216個(gè)sgRNA的單倍體干細(xì)胞（即“人造精子細(xì)胞”）文庫(kù)（大部分的單倍體干細(xì)胞攜帶一個(gè)針對(duì)不同基因的sgRNA），并通過(guò)將文庫(kù)中單倍體細(xì)胞逐一注射入小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞的方法，獲得了426只攜帶不同突變基因的半克隆小鼠。研究人員在其出生后第零天進(jìn)行骨骼整體染色分析，依據(jù)骨骼大小、鈣化、顱頂骨、長(zhǎng)骨、椎骨形態(tài)等指標(biāo)對(duì)每只小鼠進(jìn)行評(píng)分；同時(shí)，通過(guò)對(duì)每只小鼠攜帶的sgRNA進(jìn)行測(cè)序分析，研究人員定位了每只小鼠的潛在突變基因，并對(duì)骨發(fā)育異常小鼠所攜帶的靶基因進(jìn)行測(cè)序分析確定其是否突變。通過(guò)這一篩選策略，研究人員從72個(gè)候選基因中篩選出4個(gè)參與骨發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因，其中Zic1和Clec11a已被研究證實(shí)參與骨發(fā)育調(diào)控，而Rln1和Irx5在小鼠骨發(fā)育過(guò)程中的功能尚未被報(bào)道。

 

        為了驗(yàn)證Rln1和Irx5在小鼠骨骼發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，研究人員通過(guò)受精卵胞漿注射CRISPR-Cas9的方法，構(gòu)建了Rln1和Irx5敲除的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)Rln1敲除的小鼠僅在出生時(shí)表現(xiàn)為骨骼減小，而成年后差異不顯著；Irx5敲除的小鼠在出生時(shí)和成年后均表現(xiàn)為顯著的骨骼減小、骨量降低，同時(shí)伴隨著骨髓中脂肪生成增加。機(jī)制探究表明，IRX5通過(guò)抑制PPARγ的激活促進(jìn)成骨分化同時(shí)抑制脂肪生成。

 

        李勁松研究組的白梅竹博士和鄒衛(wèi)國(guó)研究組的韓玉嬌博士為該論文的共同第一作者，李勁松研究員和鄒衛(wèi)國(guó)研究員為共同通訊作者。該研究得到了生化與細(xì)胞所陳洛南研究組的大力支持。該項(xiàng)工作得到了中國(guó)科學(xué)院先導(dǎo)B、國(guó)家自然科學(xué)基金委、國(guó)家科技部、上海市科委等的經(jīng)費(fèi)資助，感謝GTP（全基因組標(biāo)簽計(jì)劃）研發(fā)中心、生化與細(xì)胞所動(dòng)物平臺(tái)和細(xì)胞分析平臺(tái)等的大力支持。

 

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