7月29日，國際學(xué)術(shù)期刊Nature Communication 在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）吳立剛和李逸平實(shí)驗(yàn)室的研究成果：“Single-cell CAS-seq reveals a class of short PIWI-interacting RNAs in human oocytes"。該研究發(fā)明了單細(xì)胞小RNA深度測序技術(shù)CAS-seq，并運(yùn)用該技術(shù)繪制了首個(gè)人和猴卵細(xì)胞的小RNA表達(dá)譜，鑒定發(fā)現(xiàn)了一類新的小RNA家族。

 

        非編碼小RNA是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)三分之一以上的基因表達(dá)，功能涉及生命活動的幾乎所有方面，因此，在單細(xì)胞水平解析和研究小RNA的表達(dá)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)意義重大。縱觀單細(xì)胞二代測序技術(shù)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和基因組測序早在十年前就已成為現(xiàn)實(shí)并得到了廣泛應(yīng)用，但小RNA由于其長度短和特殊的生化性質(zhì)，一直是單細(xì)胞測序技術(shù)領(lǐng)域的難點(diǎn)，直到最近才有突破，但大量的接頭自連副產(chǎn)物造成測序產(chǎn)出率不到20%，也無法精確檢測到低豐度的小RNA。該研究創(chuàng)新性地運(yùn)用Cas9-sgRNA復(fù)合物對非經(jīng)典的RNA/DNA雜合鏈進(jìn)行切割，從而高效、特異地清除接頭自連副產(chǎn)物，同時(shí)，研究人員引入了IVT線性擴(kuò)增技術(shù)，將小RNA序列信號線性擴(kuò)增近一千倍，極大地提高了小RNA測序的靈敏度和準(zhǔn)確性，建成高精度的單細(xì)胞小RNA深度測序技術(shù)CAS-seq。

 

        受精卵是個(gè)體生命的起點(diǎn)。對小鼠和斑馬魚的研究表明小RNA在卵細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中起著不可或缺的調(diào)控功能。而受精卵中絕大部分的小RNA都由卵細(xì)胞所貢獻(xiàn)。因此了解卵細(xì)胞中小RNA種類、豐度及在受精卵后發(fā)育過程中的動態(tài)變化尤為重要。由于缺乏有效的單細(xì)胞小RNA測序技術(shù)，目前已報(bào)道的哺乳動物卵細(xì)胞小RNA表達(dá)譜僅限于小鼠和牛，對于人和其它靈長類動物卵細(xì)胞中的小RNA譜系還是完全未知。研究人員運(yùn)用CAS-seq技術(shù)對人和食蟹猴的單個(gè)卵細(xì)胞進(jìn)行了小RNA測序，發(fā)現(xiàn)了一類長度約為20nt（堿基）的新小RNA家族，表達(dá)量占卵細(xì)胞中小RNA總量的60%。該家族的小RNA由幾十萬種不同序列的小RNA組成，第一位的堿基有極強(qiáng)的U偏好性（>98%），在基因組上集聚分布，形成幾百個(gè)簇。RIP-seq實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種小RNA與PIWI家族的PIWIL3蛋白特異性結(jié)合，因此屬于piRNA大家族。這種新類型的小RNA大量存在于人卵細(xì)胞中，在桑椹胚時(shí)期幾乎完全消失，在其它組織中不表達(dá)，長度明顯短于已知的piRNA，因此研究人員將其命名為oocyte specific short piRNA (os-piRNA)。末端氧化/測序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)os-piRNA 的3’末端沒有甲基化修飾，與已知的piRNA都不相同。結(jié)合人卵細(xì)胞錄組測序數(shù)據(jù)綜合分析發(fā)現(xiàn)os-piRNA傾向于靶向靈長類特有的轉(zhuǎn)座子元件，切割產(chǎn)生具有1U和10A序列特征的正義鏈os-piRNA。有趣的是，靈長類卵細(xì)胞中沒有endosiRNA的表達(dá)，推測os-piRNA可能替代了小鼠卵細(xì)胞中endo-siRNA沉默轉(zhuǎn)座子的功能。該研究首次繪制了人類卵細(xì)胞與早期胚胎完整的小RNA譜系，發(fā)現(xiàn)了新的os-piRNA，為研究靈長類動物卵細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中小RNA的功能和機(jī)制打開了一扇新的大門。

 

        生化與細(xì)胞所吳立剛研究員、李逸平研究員為本文通訊作者，楊其元博士、李榮紅博士、博士研究生侯麗、上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院呂祁峰醫(yī)生為本文共同第一作者。該研究得到了中科院神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)研究組、上海市計(jì)劃生育研究所施慧娟研究組以及生化與細(xì)胞所劉默芳和黃旲研究組的協(xié)助。該研究工作獲得了中科院、基金委、科技部和上海市科委的經(jīng)費(fèi)支持。

 

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