1月31日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nucleic Acids Research在線(xiàn)發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所吳立剛實(shí)驗(yàn)室的研究成果：“SpyCLIP: an easy-to-use and high-throughput compatible CLIP platform for the characterization of protein-RNA interactions with high accuracy”。該研究將SpyTag-SpyCatcher這一共價(jià)交聯(lián)系統(tǒng)創(chuàng)新性地應(yīng)用到CLIP技術(shù)中，極大地降低了CLIP技術(shù)的難度并提高了所獲數(shù)據(jù)的特異性。研究還對(duì)CLIP建庫(kù)流程進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)，使之適應(yīng)于自動(dòng)化操作和高通量應(yīng)用的要求。

 

        目前已知的RNA結(jié)合蛋白已經(jīng)超過(guò)一千種，許多過(guò)去被認(rèn)為不結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)近期亦被發(fā)現(xiàn)具有RNA結(jié)合能力，所結(jié)合的RNA對(duì)調(diào)控這些蛋白質(zhì)機(jī)器的活性發(fā)揮了重要作用。CLIP是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)-RNA相互作用最為先進(jìn)的方法之一。該方法歷經(jīng)改進(jìn)，產(chǎn)生了多種變體，但現(xiàn)有CLIP版本均依賴(lài)于高特異性的抗體，實(shí)驗(yàn)步驟繁雜，通常要采用放射性同位素標(biāo)記，所獲數(shù)據(jù)的可重復(fù)性差，無(wú)法規(guī)?；瘧?yīng)用。因此，研發(fā)簡(jiǎn)潔高效且適合高通量應(yīng)用的新方法是系統(tǒng)性理解蛋白質(zhì)-RNA相互作用的關(guān)鍵和當(dāng)務(wù)之急。

 

        本研究采用一種全新的基于SpyTag-SpyCatcher這一共價(jià)交聯(lián)系統(tǒng)的純化策略，極大地提高了所獲蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物的純度。同時(shí)對(duì)CLIP建庫(kù)的流程進(jìn)行創(chuàng)新設(shè)計(jì)，避免了傳統(tǒng)CLIP方法中多步限制規(guī)?；僮骱痛罅繐p耗起始材料的效率限制性步驟。此外，還引入通用的input文庫(kù)用以背景扣除，進(jìn)一步提高了CLIP方法的特異性。這些核心改進(jìn)不僅避免了現(xiàn)有CLIP方法對(duì)抗體的依賴(lài)，提高了數(shù)據(jù)的信噪比和可重復(fù)性，并大幅降低了操作的難度和時(shí)長(zhǎng)，使得SpyCLIP方法能夠適應(yīng)高通量研究的需求。利用SpyCLIP這一新工具，研究人員在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研究了內(nèi)含子結(jié)合蛋白PTBP1和RBFOX2的結(jié)合圖譜，發(fā)現(xiàn)SpyCLIP可以真實(shí)、高效地捕獲它們的剪接調(diào)控位點(diǎn)；研究了組蛋白mRNA專(zhuān)一性結(jié)合蛋白SLBP，發(fā)現(xiàn)SpyCLIP能以極高地特異性捕獲其與組蛋白mRNA的相互作用，并發(fā)現(xiàn)了新的非組蛋白結(jié)合對(duì)象；研究了microRNA效應(yīng)器蛋白AGO2的結(jié)合圖譜，比較和揭示了3’非翻譯區(qū)和編碼區(qū)microRNA靶位點(diǎn)的機(jī)制和特征。SpyCLIP對(duì)多種RNA結(jié)合蛋白均表現(xiàn)出杰出的靈敏度和特異性，為規(guī)?；?、系統(tǒng)性研究蛋白質(zhì)-RNA相互作用提供了一種簡(jiǎn)潔易用且具備高精度的新工具。

 

        生化與細(xì)胞所吳立剛研究員為本文通訊作者，副研究員趙雅和博士研究生張堯?yàn)楸疚墓餐谝蛔髡?。該?xiàng)研究工作得到了中科院、基金委和科技部的經(jīng)費(fèi)支持。