10月1日，國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Nature Cell Biology 在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所李勁松和陳勇研究組的最新合作研究成果“CRISPR–Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development”。該工作利用最新的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的單堿基編輯系統(tǒng) (BE3) 結(jié)合單倍體胚胎干細(xì)胞（“人造精子”）介導(dǎo)的半克隆技術(shù)，對(duì)影響小鼠原始生殖細(xì)胞（PGCs）發(fā)育的重要基因Dnd1實(shí)現(xiàn)個(gè)體水平氨基酸功能位點(diǎn)的遺傳篩選。

 

        CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)利用Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合sgRNA對(duì)靶DNA進(jìn)行切割，誘發(fā)DNA進(jìn)行非同源末端連接（Non-homologous End Joining，NHEJ)或同源重組（Homology-directed repair，HDR）損傷修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)靶基因序列突變。2016年，David R. Liu課題組建立了基于CRISPR/Cas9技術(shù)的高效誘導(dǎo)單一核苷酸突變的胞嘧啶單堿基編輯器（BE3），通過nickase Cas9蛋白（nCas9）上偶聯(lián)大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1），可以將靶位點(diǎn)C•G轉(zhuǎn)變?yōu)門•A（Komor et al., 2016, Nature）。由于該系統(tǒng)避免了傳統(tǒng)CRISPR/Cas9導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂可能帶來的損傷，迅速被國(guó)內(nèi)外科學(xué)家應(yīng)用于不同物種的基因編輯。單堿基編輯系統(tǒng)除可以進(jìn)行單個(gè)氨基酸位點(diǎn)的基因編輯以外，理論上還可以通過氨基酸位點(diǎn)的遺傳篩選進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)和功能的在體研究，不過該應(yīng)用至今未見報(bào)道。

 

        李勁松研究組長(zhǎng)期從事小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞及其應(yīng)用的研究。2012年，李勁松研究組與徐國(guó)良研究組合作首次建立了孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞，并證明這些細(xì)胞能夠代替精子使卵母細(xì)胞“受精”產(chǎn)生半克隆小鼠，不過該技術(shù)產(chǎn)生半克隆小鼠的效率低下（Yang et al., 2012, Cell）。2015年，李勁松研究組和楊力研究組合作，通過刪除兩個(gè)印記調(diào)控區(qū)域（Differentially Methylated Region, DMR）, H19-DMR和IG-DMR，獲得了能夠高效產(chǎn)生半克隆小鼠出的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞（“人造精子”）（Zhong et al., 2015, Cell stem cell）。因此他們推測(cè)，“人造精子”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)與BE3技術(shù)結(jié)合，有可能實(shí)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)關(guān)鍵氨基酸的在體遺傳篩選。

 

        為此，研究人員首先在小鼠胚胎干細(xì)胞系中，通過堿基編輯器（BE3）的N端和C端同時(shí)加上一個(gè)核定位序列，建立了高效的單堿基編輯系統(tǒng)。之后，他們將該系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠“人造精子”上，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的BE3不僅可以在“人造精子”上實(shí)現(xiàn)高效的單堿基編輯，將攜帶BE3的“人造精子”注入卵子還可以高效地產(chǎn)生純合點(diǎn)突變的半克隆小鼠。緊接著他們向“人造精子”中導(dǎo)入了一個(gè)靶向Dnd1基因的一個(gè)sgRNA慢病毒文庫(kù)（含77個(gè)sgRNA），發(fā)現(xiàn)能在半克隆小鼠中高效地誘導(dǎo)不同位點(diǎn)的單堿基突變。通過兩輪的遺傳篩選，他們發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證DND1的E59K、V60M、P76L和G82R對(duì)PGCs的發(fā)育具有重要作用。緊接著他們通過蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)、突變后蛋白的穩(wěn)定性、蛋白與蛋白相互作用等多個(gè)層次分析發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)對(duì)于DND1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和其與其它蛋白質(zhì)相互作用起著關(guān)鍵的作用。

 

        該工作在國(guó)際上首次利用堿基編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了個(gè)體水平蛋白質(zhì)關(guān)鍵氨基酸功能位點(diǎn)的遺傳篩選，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究開辟了一個(gè)新的體系。該體系的另一潛在的重要應(yīng)用是篩選的人類疾病相關(guān)基因的功能位點(diǎn)，并與已有的SNVs數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)疾病相關(guān)基因的致病位點(diǎn)。

 

        該工作在李勁松和陳勇研究員的共同指導(dǎo)下，由李勁松組博士生李慶和陳勇組博士后黎彥璟等完成。該工作得到了國(guó)家科技部、國(guó)家基金委、中國(guó)科學(xué)院B類先導(dǎo)專項(xiàng)、以及上海市科委經(jīng)費(fèi)的支持，并得到了生化與細(xì)胞研究所GTP（全基因組標(biāo)簽計(jì)劃）中心和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的支持。

 

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