2月15日，國際學(xué)術(shù)期刊Journal of Biological Chemistry 在線發(fā)表了李勁松研究組題為Haploid embryonic stem cells can be enriched and maintained by simple filtration的文章。該文章建立了一種簡(jiǎn)單、可靠且有效的單倍體細(xì)胞富集方法。

 

        多年來科學(xué)家對(duì)單倍體細(xì)胞的探索始終孜孜不倦。2011年，小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞（parthenogenetic haploid embryonic stem cells, PG-haESCs）建立。2012年，小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞（androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs）建立。隨后，大鼠、猴子和人的haESCs也相繼建立。單倍體細(xì)胞因其只含有一套染色體，不會(huì)遮蓋隱性性狀，在研究基因功能上可提供很大的幫助；它還具有干細(xì)胞的特性，能體外無限增殖且具有干性；同時(shí)小鼠的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞具有類精子的特性，主要表現(xiàn)在能使小鼠的卵母細(xì)胞受精并生出半克隆小鼠。將這些特性聯(lián)合到一起，就小鼠的haESCs而言，不僅在細(xì)胞水平同時(shí)也在個(gè)體水平搭起了研究基因功能的橋梁。

 

       然而，美中不足，haESCs自出生就伴隨著不斷自發(fā)二倍化的問題。自發(fā)二倍化也使得從ESCs建立之初，科學(xué)家就嘗試建立haESCs但沒有成功，直到流式分選技術(shù)（fluorescence activated cell sorter, FACS）被應(yīng)用到單倍體的富集上。其原理是， Hoechst染色后，不同DNA含量的細(xì)胞在激光照射下會(huì)被區(qū)分開，通過給單倍體細(xì)胞加電使其發(fā)生偏轉(zhuǎn)后收集下來，從而實(shí)現(xiàn)單倍體細(xì)胞富集。但是，Hoechst染料會(huì)一定程度影響DNA復(fù)制。 FACS富集回來的細(xì)胞第一代生長(zhǎng)狀態(tài)遠(yuǎn)不如正常傳代的細(xì)胞。而且暫不論流式分選所需的設(shè)備及費(fèi)用，整個(gè)過程中的激光照射，加電加壓等可能給細(xì)胞帶來額外潛在的基因突變。另外，該方法需要復(fù)雜、昂貴的儀器支持，富集成本高。

 

        在此背景下，李勁松研究組根據(jù)單倍體細(xì)胞與二倍化了的細(xì)胞的平均直徑的差異，通過過濾的方法在體外穩(wěn)定地維持單倍體細(xì)胞單倍體性超過30代。該過濾系統(tǒng)由商業(yè)化的一片布滿5μm或8μm小孔的濾膜與一個(gè)濾膜的支撐裝置，外加一個(gè)注射器組成。成本很低且均可實(shí)現(xiàn)無菌操作。對(duì)細(xì)胞活性及單克隆形成能力的研究發(fā)現(xiàn)過濾第一代細(xì)胞遠(yuǎn)優(yōu)于FACS富集的細(xì)胞。與此同時(shí)，過濾不同次數(shù)的AG-haESCs仍能正常支持半克隆小鼠的出生。并且，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除與敲入均可在過濾富集的細(xì)胞上正常實(shí)現(xiàn)，相應(yīng)基因敲除的半克隆小鼠也正常出生。除此之外，該方法也可用于小鼠單倍體細(xì)胞的建立以及人的單倍體細(xì)胞的富集。過濾富集單倍體細(xì)胞的方法為單倍體細(xì)胞相關(guān)技術(shù)的發(fā)展、應(yīng)用和推廣提供了保障。

 

        瞿超和晏萌為本文的共同第一作者，該研究得到清華大學(xué)陳曄光教授的幫助；工作得到了全基因組標(biāo)簽計(jì)劃（Genome Tagging Project, GTP），以及國家科技部、國家基金委、中國科學(xué)院（細(xì)胞命運(yùn)可塑性先導(dǎo)B）和上海市科委經(jīng)費(fèi)的支持；同時(shí)獲生化與細(xì)胞所公共技術(shù)服務(wù)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)的大力支持。

 

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